生物反应器培养大鼠胰岛—睾丸支持细胞复合体及体内移植的实验研究

论文摘要

胰岛移植是治疗Ⅰ型糖尿病的一种非常有效的方法。但是胰岛在体外分离过程中其活力会受到不同程度的损伤，另外胰岛移植还会引发强烈的免疫排斥反应，从而影响移植的效果。如何获得高活力的胰岛，并降低其免疫原性已经成为胰岛移植领域研究的热点。本研究拟在体外分离、培养胰岛和睾丸支持细胞（Sertoli Cell，SC），并对胰岛和SC的形态和功能进行相关检测；在生物反应器中共培养大鼠胰岛和SC，形成胰岛和SC复合体（Sertoli Islet Culture Aggregates，SICA）。对其在形态和功能上进行相关检测。在此基础上，SICA进行体内移植，观察其在体内的存活及对糖尿病大鼠血糖的影响等。通过上述研究，在体外获得了功能良好的SICA。将其进行糖尿病大鼠体内移植后，大鼠存活率显著提高且存活时间明显延长。结果表明，SICA对未来胰岛移植研究具有重要的意义。本研究主要包括以下四个部分：一、大鼠胰岛的分离、纯化与培养大鼠胰岛的分离方法常采用Dextran密度梯度离心的方法，在分离过程中常需要对胰腺组织进行二次震荡消化。本研究在前期研究的基础上，对Dextran密度梯度离心方法进行改进，在分离过程中取消了二次震荡消化过程。结果表明，改进方法后获得的胰岛具有更好的活力。葡萄糖刺激实验显示，改进方法后分离的胰岛具有更好的胰岛素分泌能力。此外，本研究还对牛血清白蛋白（BSA）在分离过程中的保护作用进行了初步研究。结果表明，在分离液中加入BSA后得到的胰岛具有更好的胰岛素分泌能力。为了进一步探讨能保持胰岛活力和功能的最佳培养条件，本研究在成功分离纯化胰岛的基础上，将胰岛放入旋转式生物反应器（Rotary Wall Vessel，RWV）中进行三维培养，结果表明，与普通平皿培养相比，经生物反应器培养的胰岛存活率和胰岛素分泌能力均得到进一步的提高。二、SC的分离培养及功能研究本研究通过Ⅴ型胶原酶单次消化法分离获得SC。通过免疫组化进行检测。结果表明，原代分离的细胞具有良好的活力，～95％细胞呈Fas-L免疫组化染色阳性。为探讨SC的功能，我们制备了SC的条件培养基，并用其培养淋巴细胞和胰岛。通过流式细胞术检测淋巴细胞的凋亡情况。结果表明，SC在体外能够诱导淋巴细胞的凋亡。对条件培养基培养的胰岛进行葡萄糖刺激实验，检测结果表明，共培养条件下胰岛的胰岛素分泌功能明显提高。三、生物反应器培养大鼠胰岛-睾丸支持细胞复合体的研究本研究采用RWV共培养大鼠胰岛与SC，使两者形成球形复合体（SICA）。通过免疫组化和透射镜等方法对其进行检测。结果表明，SC与胰岛形成一个随机分布的复合体，并能观察到SICA中有丰富的胰岛素分泌颗粒存在，表明SICA中的胰岛B细胞具有良好的生物学活性和功能。对SICA进行葡萄糖刺激实验，进一步表明，SICA具有良好的胰岛素分泌功能。四、大鼠胰岛-睾丸支持细胞复合体的体内移植研究本研究将体外培养获得的SICA进行糖尿病大鼠的体内移植。对糖尿病大鼠血糖水平的检测结果表明，SICA移植后能够延长糖尿病大鼠的存活时间。大部分接受SICA移植的受体血糖保持正常超过60d，显著高于单纯的新分离胰岛及生物反应器培养胰岛组；组织学和免疫组化结果表明，SICA在体内存活并能分泌胰岛素。葡萄糖耐受实验表明，SICA移植受体血糖基本在2h内恢复正常，与正常大鼠对葡萄糖的耐受能力接近，说明SICA移植后仍保持对葡萄糖的敏感性及良好的血糖调节能力。有报道表明，FasL，TGF-β1是SC发挥免疫豁免作用中起重要作用的两个细胞因子。我们在本实验中还对SICA体内移植物中表达FasL，TGF-β1的细胞进行了检测。结果表明，随着时间的延长，表达FasL的细胞逐渐减少，而表达TGF-β1的细胞仍然保持较高的水平。对抗FasL和TGF-β1抗体体内移植影响血糖的实验研究表明，FasL的减少并不影响SICA在移植大鼠体内正常的功能。与此相反，一旦TGF-β1减少，SICA的功能受到很大影响，导致移植大鼠的血糖升高。这说明在移植后SICA的活力与TGF-β1表达水平有关。推测TGF-β1可能在SC发挥免疫豁免作用中起重要作用。综上所述，我们在体外形成的SICA具有良好的生物学活性，移植后能够显著延长糖尿病大鼠的存活时间。这为胰岛移植治疗糖尿病奠定了相关的细胞生物学研究基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 大鼠胰岛的分离纯化与培养
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第二部分 睾丸支持细胞的分离培养及功能研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第三部分 生物反应器培养大鼠胰岛-睾丸支持细胞复合体的研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第四部分 大鼠胰岛-睾丸支持细胞复合体的体内移植研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 发表文章
• 致谢
• 已发表或待发表文章