叶绿素降解代谢调控相关基因AtNYE1在青菜中同源基因的克隆与功能研究

论文摘要

伴随着叶片的衰老,叶绿素开始快速降解。尽管叶绿素降解的生物化学途径已经逐渐揭示,但对于衰老进程中叶绿素降解的遗传调控机理一直知之甚少。本实验室通过拟南芥滞绿突变体（nye1-1）筛选和图位克隆,在国际上率先分离鉴定出了一个叶绿素降解代谢的关键调控基因AtNYE1（At4g22920,GenBank accessionnumber:DQ437531）。生物信息学分析表明,高等植物中普遍存在AtNYE1的直系同源基因。本研究利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,首先在夏冬青叶片中克隆了一个AtNYE1的同源基因BcNYE1,并对分离获得的BcNYE1全长cDNA进行了克隆和功能研究。BcNYE1的cDNA全长为963 bp,其中开放读码框（ORF）长807 bp,编码268个氨基酸;基因组全长为1,151 bp,有3个内含子和4个外显子。通过NCBIBLAST程序进行序列分析,结果表明,BcNYE1基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列与拟南芥叶绿素降解代谢关键调控基因AtNYE1（At4922920）相似性较高,达到87%。为了验证BcNYE1基因的功能,构建了植物双元表达载体pMY122 BcNYE1,采用冻融法导入农杆菌LBA4404,通过花蕾浸染法转化拟南芥滞绿突变体nye1-1。互补实验结果证明,BcNYE1基因能够异源互补拟南芥滞绿突变体nye1-1叶绿素降解缺陷的功能。实时PCR（Real-Time PCR）结果表明,BcNYE1表达受衰老诱导。从乌塌菜中分离得到了AtNYE1的同源基因BrNYE1完整编码区序列。BrNYE1的开放读码框（ORF）长870 bp,编码289个氨基酸;基因组全长为1,132 bp,有2个内含子和3个外显子。从华王青菜中分离得到了AtNYE1的同源基因完整编码区序列。该基因包含807 bp长的开放阅读框（ORF）,编码268个氨基酸;基因组全长为1,151 bp,有3个内含子和4个外显子。其序列与夏冬青BcNYE1基因序列完全一致。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 综述
• 1.1 叶片的衰老
• 1.2 滞绿与叶片衰老
• 1.3 叶绿素的降解途径
• 1.4 叶绿素降解代谢的关键调控基因AtNYE1
• 1.5 RACE（cDNA末端的快速扩增）
• 1.6 本实验的意义与方法
• 2 实验研究
• 2.1 夏冬青中AtNYE1同源基因BcNYE1的克隆和序列分析
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.3.1 BcNYE1基因全长cDNA序列的获得
• 2.1.3.2 BcNYE1基因的生物信息学分析
• 2.1.3.3 BcNYE1基因组序列的克隆与分析
• 2.1.4 讨论
• 2.2 BcNYE1基因的功能验证及表达分析
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.3 结果与分析
• 2.2.3.1 BcNYE1基因功能验证（互补实验）
• 2.2.3.2 自然衰老状态下BcNYE1基因表达模式
• 2.2.3.3 夏冬青叶片在黑暗处理条件下总叶绿素含量分析
• 2.2.4 讨论
• 2.3 乌塌菜和华王青菜中AtNYE1同源基因的克隆
• 2.3.1 材料与试剂
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.3 结果与分析
• 2.3.3.1 乌塌菜,华王青菜中AtNYE1同源基因序列的获得
• 2.3.3.2 BrNYE1基因的生物信息学分析
• 2.3.3.3 基因组序列的克隆与分析
• 2.3.4 讨论
• 参考文献
• 致谢