论文摘要
血压在一定范围内自发地连续波动的性质称为血压波动性（blood pressurevariability,BPV）。当这种波动超过正常范围,即称之为血压波动性增高。大鼠去窦弓神经（sinoaortic-denervated,SAD）可引起BPV明显增高,但24小时平均动脉血压并不增加。SAD大鼠有左心室肥厚及血管、肾和脑组织损伤的表现。在高血压的研究中也发现,BPV与靶器官损伤密切相关,目前BPV增高能够导致靶器官损伤已成定论。深入研究BPV增高导致靶器官损伤的机制,寻求减轻BPV增高引起脏器损伤的途径是减轻高血压靶器官损伤的重要措施,具有重要意义。微循环是物质能量信息交换的重要场所,血管内皮细胞的正常是维持微循环正常功能的重要因素,微循环异常会引起组织器官的损伤。高血压时存在微循环异常,从而我们认为,BPV增高导致器官损伤的机制中可能有微循环异常的参与,故以左心室肥厚作为器官损伤的代表指标,提出假设:微循环异常是BPV增高导致左心室肥厚的原因之一。实验目的:1.探讨SAD大鼠微循环异常在左心室肥厚中的作用。2.研究体外压力波动对血小板的活化作用。实验第一部分为整体实验。应用BPV增高的动物模型——SAD大鼠,以左心室重量指数、左室壁厚度、左室胶原容积分数、左室心肌横截面积作为评价左心室肥厚的指标,以血管内皮细胞损害、毛细血管密度改变、血液粘度和血细胞变化作为评价微循环变化的指标,从时程上观察SAD大鼠左心室肥厚及与左心室微循环变化的关系,然后观察尼群地平对SAD大鼠微循环的影响和对左心室肥厚的改善作用。实验第二部分为体外实验。血小板粘附聚集功能的增强会导致血液性质的变化,引发微循环异常。如果不考虑血管调节的因素,血压波动性的增高将引起血流波动性的增高,这对于血小板而言是一定意义上的机械刺激,结合血小板易被机械刺激激活的特性,我们推测:压力波动性增高能够激活血小板。该部分中,以血液流动状态下研究血小板粘附的灌流小室为基础,首先建立体外血流波动模型,观察血流波动对血小板功能的影响及机制。同时观察该模型中压力波动的变化及与血流波动之间的关系,最后分析压力波动性增高对血小板的活化作用。实验方法:1.将Sprague-Dawley（SD）大鼠行SAD:大鼠麻醉后,紧贴迷走神经切断喉上神经约5mm,随之从颈动脉鞘中仔细分离出颈总动脉和迷走神经干,将剩下的组织（含主动脉神经,交感干及动脉鞘组织）一并切断约5mm。然后分离摘除颈上神经节,再分离颈总动脉分叉处血管外周组织,使颈总动脉,颈内动脉,颈外动脉,枕动脉完全游离约5mm,用少量10%苯酚乙醇溶液涂擦创面。术后动物随机分为2、4、8和16周组,在清醒自由活动状态下,应用MPA生物信号记录系统检测动脉血压及血压波动性和压力感受性反射功能的变化。2.另将SD大鼠行SAD,术后动物随机分为2、4、8和16周组,同时设尼群地平治疗组（SAD+Nit）,SAD术后喂食含尼群地平的药饲料16周,剂量10mg/kg/d。在相应的时间点称重,取血,计数血细胞,检测血液流变学,应用灌流小室技术在血液流动状态下测定血小板粘附率的变化,共聚焦技术测定血栓高度,应用流式细胞术检测血小板表面P-选择素的表达,应用ELISA和硝酸还原酶法分别测定血浆vWF、VEGF和NO的含量。取左心室心肌组织行病理学检查和VG染色,应用碱性磷酸酶染色检测毛细血管密度,应用实时荧光PCR和western印迹法,检测VEGF、Flt-1、Flk-1 mRNA和蛋白的表达。用相关分析方法研究左心室肥厚指标与微循环异常参数之间的关系。3.血液在微量注射/抽吸泵吸引下注入灌流小室,每间隔15秒钟,在低血流(58μl/min,切变率300S-1)与高血流(252μl/min,切变率1300S-1)交替变换一次,建立血流波动模型,并应用激光多普勒血流仪实时监测灌流小室血流变化,血流波动性以5min内血流量变化的标准差表示。应用灌注小室、胶原或vWF粘附表面,在低血流量(58μl/min,切变率300S-1)、高血流量(252μl/min,切变率1300S-1)和血流波动状态灌流5分钟,测定血小板的粘附率。同时应用流式细胞术检测血液灌流前后,血小板表面P-选择素和PAC-1的表达。应用MPA生物信号记录系统,实时测定低血流量、高血流量和血流波动状态压力和压力波动性的变化,并分别与血流和血流波动性进行相关性分析。实验结果:1.SAD大鼠血流动力学和动脉压力感受性反射功能变化特征（1）与假手术组比较,SAD 2、4、8和16周大鼠SBP、DBP、MBP、HR、HRV无明显差别,但其SBPV、DBPV和MBPV均显著增高,提示SAD大鼠呈现出单纯BPV增高的表现;（2）SAD 2、4、8和16周大鼠对去氧肾上腺素的升压反应无明显差别,但其心率减慢作用显著降低,表明SAD后大鼠动脉压力感受性反射功能明显受损。2.SAD大鼠左心室大体形态结构基本改变与相应假手术组比较,SAD2、4、8和16周大鼠的体重显著减轻。SAD4周、8周和16周大鼠心脏重量、心脏重量指数（心脏重/体重）、左心室重量、左心室重量指数（左心室重/体重）和左心室壁厚均显著增加。左心室组织切片染色显示心肌肥大、断裂、坏死和胶原纤维增加,左心室胶原容积分数和心肌横截面积也显著增加。表明SAD4周后大鼠存在左心室肥厚。3.SAD大鼠微循环的变化（1）与相应假手术组比较,SAD 2、4、8和16周大鼠血浆中vWF和VEGF含量显著增高,左心室VEGFmRNA和蛋白表达上调,血浆NO水平显著降低,提示SAD大鼠存在血管内皮功能的异常。（2）与相应假手术组比较,SAD4周、8周和16周大鼠左心室心肌毛细血管密度显著降低。（3）与相应假手术组比较,SAD2周至16周大鼠,左心室Flk-1 mRNA和蛋白表达上调,但Flt-1 mRNA和蛋白表达无显著变化。（4）与相应假手术组比较,SAD 2、4、8和16周大鼠红细胞、白细胞和血小板计数无明显差异,但血小板体积、大血小板比率和血小板分布宽度明显增加,提示存在血小板异常。（5）与假手术组比较,SAD 2、4、8和16周大鼠,在剪切率1 s-1、30 s-1、200 s-1时全血粘度均显著增高,血浆粘度也显著增高,在剪切率300s-1时血小板粘附率和血栓高度显著增加,血小板表面P-选择素表达阳性率显著上升,提示SAD大鼠微循环管内因素的异常。4.尼群地平对SAD大鼠左心室肥厚及微循环的影响（1）与相应SAD16周大鼠相比,应用16周尼群地平使大鼠心脏重量指数、左心室重量指数、左心室壁厚、左心室胶原容积分数和心肌横截面积均显著降低。组织病理学检查发现,应用尼群地平大鼠心肌细胞肿胀和肥大明显减轻,胶原纤维减少。提示尼群地平对SAD大鼠左心室肥厚有改善作用。（2）与SAD16周大鼠相比,应用尼群地平大鼠血浆vWF和VEGF含量显著降低,左心室VEGF mRNA和蛋白表达下调,血浆NO水平显著升高。提示尼群地平能够保护SAD大鼠内皮细胞功能。（3）尼群地平显著增高左心室毛细血管密度,导致左心室Flk-1 mRNA和蛋白表达下调,对Flt-1 mRNA和蛋白表达无影响。（4）尼群地平显著降低SAD大鼠血小板体积、大血小板比率和血小板分布宽度,显著降低全血粘度、血浆粘度、血小板粘附率和血栓高度,使血小板表面P-选择素阳性表达率显著减少。提示尼群地平能够改善SAD大鼠血液粘度的异常,降低血小板的粘附聚集功能。5.左心室肥厚与微循环异常因素之间的关系对SAD大鼠进行相关分析结果表明,作为左心室肥厚指标的左心室重量指数（左心室重/体重）、左心室壁厚、左心室胶原容积分数、左心室心肌横截面积,均与血浆NO、左心室毛细血管密度负相关,而与血浆vWF、血浆和左心室VEGF蛋白水平、P-选择素阳性百分率、血液粘度正相关。6.体外压力波动对血小板功能的影响（1）多普勒血流仪监测结果表明,血流波动状态的血流量(58μl/min,切变率300S-1)比低血流量时显著增加,比高血流量(252μl/min,切变率1300S-1)时显著减少,但血流波动状态时的血流波动性比高血流量时和低血流量时显著增高,提示血流波动模型成功。（2）高血流量时血小板对胶原蛋白和vWF的粘附率比低血流量时显著增加,血流波动状态血小板对胶原蛋白和vWF的粘附率比高、低血流量时均显著增加。经胶原蛋白和vWF粘附表面灌流后,与灌流前血液相比,血流波动状态下血小板表面P—选择素的表达显著增高,高、低血流量状态下,血小板表面P—选择素的表达无显著变化。在三种血流状态下,血小板表面PAC-1表达也均无显著变化。（3）血流波动状态时灌流小室内压力比低血流量时显著增加,比高血流量时显著减少;但血流波动状态时的压力波动性比高血流量和低血流量时均显著增加。灌流小室压力与小室血流量之间、压力波动性与小室血流波动性之间都具有显著正相关性,提示体外血流模型中波动血流呈现压力波动状态,体外血流模型即为压力波动模型。从压力波动性的角度来看,压力波动性增高能够活化血小板,可能与引起血流波动而直接激活血小板有关。实验结论:研究结果取得下列新的结论:1.血压波动性增高较早期导致左心室微循环的异常,以血管内皮细胞损害、血液粘度增高和毛细血管密度减少为特征,随后左心室肥厚出现,这些变化出现后即持续存在。2.压力波动产生的机械刺激能够激活血小板,血小板活化是血压波动性增高导致微循环异常的机制之一。3.微循环异常是血压波动性增高导致左心室肥厚的原因之一。4.尼群地平显著改善血压波动性增高导致的左心室肥厚,机制可能与改善左心室微循环异常有关。本实验有助有进一步阐明BPV增高导致器官损伤的机制,提示在心血管病器官损伤的防治中可应用改善微循环异常的途径。