不同种源千年桐遗传结构差异分析

论文摘要

油桐属植物千年桐（Vernicia Montana）是我国特有的工业油料树种,栽培历史悠久,油量含量高,用途广泛,是目前我国最为理想的生物柴油原料树种之一,国内外对千年桐的研究主要集中在生理生化、苗木栽培和资源开发利用等方面,对其在分子标记和遗传育种等方面的研究很少,本论文采用RAPD分子标记方法对千年桐11个种源的33个个体进行了分子标记实验,对千年桐遗传结构差异分化和亲缘关系变异规律等进行了研究,为不同种源千年桐遗传结构变异规律、亲缘关系划分、种质资源保护和良种选育提供了理论基础。比较CTAB法和植物基因组DNA提取试剂盒法,本文选取了DNA纯度较高,杂质含量少,蛋白质和酚的残留少,RNA的污染较少,浓度适中,DNA扩增条带比较完整,总量较多,清晰明亮,拖尾少的植物基因组DNA提取试剂盒法作为千年桐总DNA提取的最佳方法。对dNTP、Tag酶、引物、模板DNA和Mg2+五个反应物的含量和退火温度做梯度优化实验,最后确定的千年桐RAPD-PCR扩增程序为:94℃预变性3min,94℃变性1min,36.4℃退火1min,72℃延伸1.5min,循环44次,再72℃后延伸5min。PCR反应最佳体系为总体积25μl, dNTP（2.5mmol/l） 3.0μl,Tag酶（2.5U/μl）0.4μl,引物（5μmol/l）1.5μl,DNA（10ng/μl）2.0μl,Mg2+（25 mmol/l）3.0μl,10×PCR buffer2.5μl,灭菌超纯水12.6μl。对105条随机引物进行筛选,筛选出的14条特异性引物对11个种源的33个千年桐的样品进行RAPD扩增,总共得到130条DNA条带,其中多态性条带为119条,多态百分率为91.54%,平均每条引物扩增出8.5条多态性条带,表明不同种源的千年桐样品之间存在较大的遗传差异。11个种源Nei’s观测等位基因数Na=1.8923和1.8769,Nei’s有效等位基因数Ne=1.5248和1.4896,Nei’s基因多样性H=0.3088和0.2949,Shannon’s信息指数I=0.4639和0.4472,这四项衡量各个居群遗传多样性的重要指数都显示了11个种源之间具有较高的遗传多样性水平。政和（H=0.2631,I=0.3892）、潭城（H=0.2669,I=0.3887）、书坊（H=0.2617,I=0.3819）、机关（H=0.2533,I=0.3751）和小湖（H=0.2218,I=0.3316 ）五个种源的Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数比较高且接近,这五个种源构成了遗传多样性的第一水平。沙县（H=0.1679,I=0.2452）、尤溪（H=0.1287,I=0.1886）和莆田（H=0.1226,I=0.1797）三个种源的Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数依次降低,这三个种源地地理位置比较分散,距离较远,杂交和种间交流较少,种质资源保存较好,纯合度高。黄坑（H=0.1045,I=0.1530）、徐市（H=0.0898,I=0.1289）和漳墩（H=0.0748,I=0.1079）三个种源的Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数较低且接近,遗传多样性不高。11个种源的千年桐之间,亲缘关系最远的是种源机关与种源漳墩,遗传距离为0.3693,亲缘关系较远的是种源机关与种源黄坑,以及种源漳墩与种源政和和种源小湖,遗传距离分别为0.3271、0.3286和0.3174。亲缘关系最近的是种源尤溪与种源徐市,遗传距离为0.0510,亲缘关系较近的是种源黄坑与种源徐市,遗传距离为0.0603。11个种源的千年桐之间相似系数的范围为0.9503到0.6912之间,相似度最高的是种源尤溪与种源徐市,相似度最低的是种源机关与种源漳墩,说明各个种源地之间交流比较频繁,多态性比较丰富,遗传范围比较广泛,而且地理环境的复杂程度也会影响种源之间的交流与变异。各个种源之间的相似系数基本上都在1以下,但是差距不大,最大相似系数是0.9503,最小是0.6912,两者差距只有0.2591,各个个体之间都能聚合在一起,大部分的个体都聚集在距离0.27左右,说明大部分样品之间的遗传背景相似,受地理环境的影响不大。采用popgen软件对不同种源千年桐进行亲缘关系聚类,11个种源的千年桐明显的分为两个大的聚类和四个小的聚类,较为明显的是莆田种源单独成为一支,这说明莆田种源与别的种源距离较远,交流较少,纯合度较高;另外两个三明种源与距离它们较近的徐市种源聚合在一起,说明它们之间由于地理距离的接近而使它们之间的交流比较多,相似度比较高,亲缘关系比较接近;建阳的黄坑与漳墩两个种源的地形比较复杂,导致它们与外界的其它种源交流较少,与建阳别的种源之间的差异较大,潭城、政和、书坊、小湖和机关5个种源聚合成一个大的聚类,这表明这5个种源之间的地理位置接近,亲缘关系也相对接近。利用Dps软件对千年桐33个个体进行遗传聚类,11个种源的33个个体总体上分成4个部分,基本上和种源聚类图的结果一致,呈现种源内部与种源间交相聚合,地理距离较近的种源之间聚合度高,反之较低,地理交界区域的种源聚合度也很高,区分度也更加仔细。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 千年桐的生物学特性及用途
• 1.1.1 生物学特性
• 1.1.2 用途
• 1.2 国内外相关研究现状
• 1.2.1 分子标记技术在木本油料植物中的应用
• 1.2.2 千年桐的研究进展
• 1.2.3 千年桐发展前景及建议
• 1.3 本论文的研究目的与拟解决的问题
• 2 实验材料与实验方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验样品采集
• 2.1.2 实验样品保存
• 2.1.3 实验仪器与试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA 提取方法
• 2.2.2 DNA 样品的检测方法
• 2.2.3 RAPD 分子鉴别与筛选的方法
• 2.2.4 遗传多样性数据处理方法
• 3 结果与分析
• 3.1 千年桐基因组DNA 质量和浓度检测结果
• 3.2 RAPD-PCR 扩增程序和反应体系确定
• 3.2.1 dNTP 最佳用量的确定
• 3.2.2 Tag 酶最佳用量的确定
• 3.2.3 引物最佳用量的确定
• 3.2.4 模板DNA 最佳用量的确定
• 2＋最佳用量的确定'>3.2.5 Mg^2＋最佳用量的确定
• 3.2.6 最佳退火温度的确定
• 3.3 引物筛选结果
• 3.4 RAPD 扩增结果及分析
• 3.4.1 琼脂糖凝胶电泳检测所有样品DNA 扩增条带结果
• 3.4.2 不同种源千年桐RAPD 扩增位点差异分析
• 3.4.3 不同种源千年桐遗传多样性水平差异分析
• 3.4.4 千年桐各个居群遗传距离和遗传相似度差异分析
• 4 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.1.1 DNA 提取方法
• 4.1.2 RAPD 扩增程序和反应体系
• 4.1.3 RAPD 引物的筛选
• 4.1.4 遗传结构与遗传多样性
• 4.2 讨论
• 4.2.1 关于千年桐总 DNA 的提取
• 4.2.2 关于 RAPD 反应体系的优化
• 4.2.3 关于千年桐 RAPD 反应引物的筛选
• 4.2.4 关于千年桐遗传图谱的构建与各个样品之间亲缘关系的分析
• 4.2.5 关于进一步研究的问题和方向
• 参考文献
• 致谢