普鲁兰短梗霉HN2-3脂肪酶的生产、分离纯化、基因克隆和表达的研究

论文摘要

从盐场分离到一株高产脂肪酶的酵母菌HN2-3,经酵母常规鉴定方法和分子生物学方法鉴定为普鲁兰短梗霉。该酵母生产脂肪酶最佳培养基组分为3.0% （w/v）橄榄油、0.4% （w/v）葡萄糖、0.6% （w/v）硫酸铵、0.1% （w/v） K2HPO4和0.05% （w/v） MgSO4.7H2O,最佳培养条件为初始pH 7.0、培养温度25 oC和转速170rpm。我们发现橄榄油的添加时间对于脂肪酶的生产具有很大的影响,在接种培养6 h后加入橄榄油,继续培养96 h,脂肪酶产量达到最大,酶活力达到8.0 U/ml。普鲁兰短梗霉HN2-3胞外脂肪酶通过硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析得到纯化,纯化倍数为3.4。SDS- PAGE显示该脂肪酶分子量约为63.5 kDa。纯化酶的最适作用pH和最适作用温度分别为8.5和35oC,该酶被Hg2+, Fe2+和Zn2+强烈抑制。同时苯甲基磺酰氟可以强烈抑制该脂肪酶的活性,乙二胺四乙酸对该纯化酶的影响不大,碘乙酸可以微弱抑制该酶的活性。纯化的脂肪酶对于花生油具有较强的水解活性。利用RACE的方法克隆了普鲁兰短梗霉HN2-3胞外脂肪酶的基因。该基因含有一个1245bp的ORF框,同时发现从基因组克隆得到的脂肪酶基因序列中含有一个55bp的内含子。该基因编码一个414个氨基酸残基的蛋白质,在氨基端含有一个26个氨基酸残基的信号肽。推导氨基酸序列含有脂肪酶的保守序列（G-X-S-X-G）和3个推测的N-糖基化位点。通过脂肪酶系统进化树分析,普鲁兰短梗霉HN2-3脂肪酶与Aspergillus fumigatu（sXP750543）和Neosartorya fischeri （XP001257768）脂肪酶亲缘关系最近,同源性分别为50%和51%。将脂肪酶基因克隆到pET-24a （+）表达载体上,并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了表达。SDS-PAGE和免疫印迹分析发现重组蛋白的分子量约为47kDa。测定了阳性克隆BL21（DE3）/pET-24a（+）LIP1细胞裂解液的脂肪酶活力,达到0.96 U/mg。重组脂肪酶最适作用pH和最适作用温度分别为8.0和35°C,重组脂肪酶依然对花生油具有较高的水解活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 脂肪酶简介
• 1.1 脂肪酶的结构与催化机理
• 1.2 微生物脂肪酶的水解特异性
• 1.2.1 位置特异性
• 1.2.2 脂肪酸特异性
• 1.2.3 立体特异性
• 1.3 脂肪酶活力的测定
• 2 微生物脂肪酶的生产
• 2.1 产脂肪酶微生物的分离
• 2.2 脂肪酶的发酵生产
• 2.2.1 碳源影响
• 2.2.2 氮源影响
• 2.2.3 金属离子的影响
• 2.2.4 pH 对产酶的影响
• 3 脂肪酶的分离纯化及性质研究
• 3.1 假丝酵母脂肪酶
• 3.2 地丝菌脂肪酶
• 3.3 丝孢酵母脂肪酶
• 4 微生物脂肪酶分子生物学的研究
• 4.1 脂肪酶基因的克隆方法
• 4.1.1 基因组文库和cDNA 文库的构建和基因的筛选
• 4.1.2 简并引物克隆和其它扩增方法结合克隆基因
• 4.2 细菌脂肪酶
• 4.3 真菌脂肪酶
• 5 微生物脂肪酶的应用
• 5.1 脂肪水解
• 5.2 皮革生产
• 5.3 纸浆和造纸
• 5.4 加酶洗涤剂
• 5.5 食品成分
• 5.6 医学应用
• 5.7 合成手性化合物
• 5.8 油脂改性
• 5.9 药物和化妆品
• 6 本论文的研究目的与意义
• 7 本论文研究和讨论的主要内容
• 第二章 A. PULLULANS HN2-3 脂肪酶生产条件的优化
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株
• 2.2 培养基与试剂
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 试剂
• 2.3 方法
• 2.3.1 脂肪酶酶活测定方法
• 2.3.2 发酵培养基的优化
• 3 结果与讨论
• 3.1 不同碳源对产酶的影响
• 3.2 不同氮源对产酶的影响
• 3.3 不同金属离子对产酶的影响
• 3.4 不同初始PH 及培养温度对产酶的影响
• 3.5 橄榄油添加时间对产酶的影响
• 4 本章小结
• 第三章 A. PULLULANS HN2-3 脂肪酶的分离纯化及性质研究
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株
• 2.2 培养基和试剂
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 试剂
• 2.3 方法
• 2.3.1 脂肪酶的分离纯化
• 2.3.2 脂肪酶的性质研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 脂肪酶的分离纯化
• TM G-75 凝胶过滤'>3.1.1 Sephradex^TM G-75 凝胶过滤
• 3.1.2 DEAE-Sephorose Fast Flow 阴离子交换层析柱纯化
• 3.1.3 蛋白酶纯化过程参数和不连续SDS-PAGE 凝胶电泳
• 3.2 纯化脂肪酶的性质研究
• 3.2.1 纯化脂肪酶的最适作用温度及热稳定性
• 3.2.2 纯化脂肪酶的最适作用pH 及pH 稳定性
• 3.2.3 金属离子对纯化酶活性的影响
• 3.2.4 蛋白抑制剂对纯化酶活性的影响
• 3.2.5 酶的动力学常数
• 3.2.6 纯化酶对油脂的水解实验
• 4 本章小结
• 第四章 A. PULLULANS HN2-3 脂肪酶基因的克隆
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株与质粒
• 2.2 培养基和试剂
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 试剂
• 2.3 方法
• 2.3.1 A. pullulans HN2-3 基因组DNA 的提取
• 2.3.2 A. pullulans HN2-3 总RNA 的提取及第一条cDNA 链的合成
• 2.3.3 脂肪酶部分cDNA 基因的克隆
• 2.3.4 RACE
• 2.3.5 从基因组DNA 扩增脂肪酶的基因
• 2.3.6 脂肪酶生物信息学分析
• 3 结果和讨论
• 3.1 脂肪酶部分CDNA 基因的克隆
• 3.1.1 简并引物的设计
• 3.1.2 简并引物PCR 克隆脂肪酶部分cDNA 序列
• 3.2 RACE
• 3.2.1 3’RACE PCR
• 3.2.2 5’RACE PCR
• 3.2.3 ORF 框的获得
• 3.3 从基因组DNA 扩增脂肪酶基因
• 3.4 A. PULLULANS HN2-3 脂肪酶基因LIP1 序列分析
• 3.5 A. PULLULANS HN2-3 脂肪酶推导氨基酸序列（LIP1）分析
• 4 本章小结
• 第五章 A. PULLULANS HN2-3 脂肪酶基因CDNALIP1 在大肠杆菌中的表达
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.2 培养基和试剂
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 试剂
• 2.3 方法
• 2.3.1 pET-24a（+）LIP1 表达载体的构建
• 2.3.2 pET-24a（+）LIP1 在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.3.3 重组脂肪酶的性质
• 3 结果与讨论
• 3.1 PET-24A（+）LIP1 表达载体的构建
• 3.2 PET-24A（+）LIP1 在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.3 重组脂肪酶的性质
• 3.3.1 温度对重组脂肪酶活性的影响
• 3.3.2 pH 对重组脂肪酶活性的影响
• 3.3.3 重组脂肪酶水解油脂实验
• 4 本章小结
• 参考文献
• 总结与创新点
• 攻读博士期间发表论文
• 致谢