从芋螺基因组中分离克隆毒素基因的研究

论文摘要

芋螺毒素（conotoxin, conopeptide,简称CTX）是一大类活性多肽,它们是生活于热带海洋中软体动物芋螺（Conus）的毒管分泌出的毒液中的主要成分,用以麻弊猎物以及防御攻击。近几十年来的研究表明,CTX通常由7-46个氨基酸残基组成,富含半胱氨酸（Cys）,具有动物神经肽毒素活性的一类小肽。它们分子量小,化学结构多样,功能独特、专一,生物活性极强,作用靶位广泛且选择性强,已逐渐成为神经科学研究的有利工具以及新药开发的重要来源。目前发现的芋螺毒素主要根据其信号肽序列的和二硫键连接方式的不同,可分为A-, T-, O-, M-, P-, I-和S-超家族等。由于CTX是基因直接表达的产物,现代基因工程技术促进了CTX的研究与开发。目前,根据α-CTX基因和O-CTX基因的信号肽保守序列、内含子保守序列及3′-UTR序列,分别设计两类毒素基因的特异PCR引物,从芋螺基因组DNA和cDNA文库中筛选新型的α-CTX基因和O-CTX基因,成为发现新型两类毒素基因的重要方法。据此,本研究分别根据已知的α-CTX基因和O-CTX基因各自信号肽保守序列和内含子保守序列及3’-UTR序列,设计多组特异PCR引物,以桶形芋螺（C.betulinus Linnaeus）、疣缟芋螺（C. lividus Hwass）、织锦芋螺（C. textile Linnaeus）的基因组DNA为模板,进行PCR扩增并进行PCR条件的优化。扩增所获得的基因片段经测序并推导相应编码产生的毒素肽氨基酸序列,然后与已知的毒素基因序列比对。结果表明,从三种芋螺中分别筛选出37条α-CTX基因（含35条新型α-CTX基因以及2条已报道的α-CTX基因）、从疣缟芋螺（C. lividus Hwass）中筛选出3条O-CTX基因,为更多α-CTX和O-CTX的发现、化学合成、活性鉴定和应用研究提供基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分:文献综述
• 1.1 芋螺毒素（CTX）的研究概述
• 1.1.1 芋螺毒素的分类及命名
• 1.1.2 芋螺毒素的分子生物学特征及翻译后修饰
• 1.1.3 芋螺毒素的获得途径
• 1.1.4 芋螺毒素的药理学活性
• 1.1.5 芋螺毒素研究的发展趋势
• 1.2 α-芋螺毒素（α-CTX）概述
• 1.2.1 α-CTX的分子生物学特征
• 1.2.2 α-CTX基因的研究现状
• 1.2.3 α-CTX的生物学活性
• 1.2.4 α-CTX的药用价值和发展前景
• 1.3 O-芋螺毒素（O-CTX）概述
• 1.3.1 O-CTX的分子生物学特征
• 1.3.2 O-CTX基因的研究现状
• 1.3.3 O-CTX的生物学活性
• 1.3.4 O-CTX的药用价值和发展前景
• 1.4 研究目的与意义
• 1.5 研究内容
• 1.6 技术路线
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验用芋螺种类
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 引物设计
• 2.1.4 实验试剂
• 2.1.5 培养基与抗生素
• 2.1.6 试剂溶液和缓冲液
• 2.1.7 实验设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 芋螺基因组DNA的提取
• 2.2.2 PCR扩增芋螺毒素基因
• 2.2.2.1 α-CTX基因的PCR扩增
• 2.2.2.2 O-CTX基因的PCR扩增
• 2.2.3 目的基因纯化和胶回收
• 2.2.4 目的基因和载体的连接转化及PCR鉴定
• 2.2.4.1 目的基因和载体的连接反应
• 2.2.4.2 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2.2.4.3 大肠杆菌感受态菌转化效率检测
• 2.2.4.4 转化大肠杆菌及蓝白斑筛选
• 2.2.4.5 质粒小量提取
• 2.2.4.6 PCR验证重组子
• 2.2.5 所获序列进行比对
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 芋螺基因组DNA的结果
• 3.2 PCR扩增芋螺毒素基因
• 3.2.1 α-CTX基因的PCR扩增
• 3.2.2 O-CTX基因的PCR扩增
• 3.3 目的基因纯化和胶回收
• 3.4 目的基因和载体的连接转化及PCR鉴定
• 3.5 序列比对结果
• 第四部分 讨论
• 4.1 芋螺基因组DNA的提取
• 4.2 PCR扩增芋螺毒素基因
• 4.2.1 α -CTX基因的PCR扩增
• 4.2.2 O-CTX基因的PCR扩增
• 4.3 目的基因和载体的连接转化及PCR鉴定
• 4.4 序列比对结果
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文