猪抑肌素基因剔除成纤维细胞系的建立及体外发育

论文摘要

猪抑肌素基因myostatin又称GDF-8（growth/differentiation factor-8）,属于TGF-β超家族,是具有调控肌肉重量的一种分泌型糖蛋白因子。该基因与骨骼肌总量的调节有关,其基因编码区保守部分的突变将使得肌肉的发育失去负调控作用而导致肌肉肥大。在自然界中存在Myostatin基因突变导致的比利时蓝牛和皮特蒙特牛的双肌表型,该基因的发现,为育种工作者提供了新的科研思路,为进一步提高动物产肉性能提供了有力的事实依据,为分子水平定向育种奠定了坚实的理论基础。因此育种工作者除了可以利用现有的双肌动物进行繁育外,还可以采用基因打靶技术来剔除Myostatin基因,获得转基因克隆动物,以达到改进肌肉质量和重量的目的,为家畜的高质高效生产提供新技术。目前,基因打靶技术已经成为研究基因功能的重要技术之一。它是80年代后半期基于DNA同源重组原理发展起来的一门新技术,是一种定向改变细胞或生物个体遗传信息的实验手段。通过对生物体遗传信息的定向修饰,并使修饰后的遗传信息在生物体内遗传,表达突变性状,从而达到对其基因功能的研究。本实验采用胰酶消化法和组织块法,建立大白猪的胎儿成纤维细胞系;采用脂质体转染法将构建好的打靶载体导入大白猪胎儿成纤维细胞中,并对转染条件:脂质体浓度、质粒微克数、转染时间、G418筛选浓度和维持浓度等条件进行了优化;转染后的大白猪胎儿成纤维细胞采用G418筛选,然后继续用含G418和GANC的培养液维持筛选;最后采用PCR法鉴定所得细胞株;将所获得的阳性细胞移入去核的猪卵母细胞内,构建克隆胚,进行体外发育。本研究认为,采用胰酶消化法和组织块法均可以很好的建立大白猪的胎儿成纤维细胞系;脂质体4μl,质粒2μg,转染6 h为最优转染体系;G418筛选浓度采用300μg/ml,维持浓度采用200μg/ml,GANC采用2μmol/L的体系为最优筛选体系。经PCR鉴定后,成功的得到了猪抑肌素基因剔除的成纤维细胞系;核移植后获得的重构胚在体外发育至囊胚。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 Myostatin 基因概况
• 1.1.1 Myostatin 基因的发现
• 1.1.2 Myostatin 基因的结构
• 1.1.3 Myostatin 基因的保守性
• 1.1.4 Myostatin 基因表达研究
• 1.1.5 Myostatin 基因的生物学功能
• 1.1.6 Myostatin 基因的应用前景
• 1.2 基因打靶技术
• 1.2.1 基因打靶技术的概念
• 1.2.2 基因打靶载体类型
• 1.2.3 实现基因敲除的途径
• 1.2.4 基因敲除技术的应用
• 1.3 转基因动物
• 1.3.1 外源基因导入受体细胞方法
• 1.3.2 转染细胞的筛选方法
• 1.3.3 体细胞核移植的研究
• 1.3.4 转基因猪的研究概况及其应用前景
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要器材
• 2.1.2 主要药品及配制
• 2.1.3 DNA 分析软件与网址
• 2.1.4 实验动物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大白猪成纤维细胞体外培养体系的建立
• 2.2.2 Myostatin 转染质粒的准备
• 2.2.3 打靶载体转染大白猪胎儿成纤维细胞
• 2.2.4 阳性细胞核移植的体外发育
• 3 结果与分析
• 3.1 细胞培养的结果
• 3.1.1 胰酶消化法大白猪胎儿成纤维细胞的培养
• 3.1.2 组织块法大白猪胎儿成纤维细胞的培养
• 3.1.3 细胞的冻存和复苏
• 3.1.4 大白猪胎儿成纤维细胞的生长曲线
• 3.1.5 大白猪胎儿成纤维细胞的核型分析
• 3.2 转染质粒扩繁结果
• 3.2.1 无内毒素质粒的提取
• 3.2.2 质粒的酶切鉴定结果
• 3.2.3 线性化载体的纯化
• 3.3 转染的结果
• 3.3.1 G418 筛选浓度的选择结果
• 3.3.2 转染条件的优化
• 3.3.3 细胞筛选结果
• 3.3.4 阳性细胞核型分析结果
• 3.3.5 阳性细胞DNA 提取结果
• 3.3.6 阳性细胞PCR 检测结果
• 3.3.7 转染前细胞内RNA 提取结果
• 3.3.8 阳性细胞RNA 提取结果
• 3.3.9 转染前后细胞中Myostatin 基因表达量的差异
• 3.3.10 重构胚在体外发育情况
• 4 讨论
• 4.1 细胞供体的年龄的选择
• 4.2 细胞培养体系的建立
• 4.3 细胞的分离纯化
• 4.4 转染方法
• 4.5 打靶载体的选择
• 4.6 G418 筛选浓度的选择
• 4.7 关于GANC 筛选
• 4.8 关于筛选后阳性细胞的培养
• 4.9 关于阳性细胞核型
• 4.10 关于阳性细胞的鉴定
• 4.11 转染前后 Myostatin 基因表达的检测
• 4.12 核移植
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文