水通道蛋白4在人创伤性脑水肿早期表达的研究

论文摘要

目的：急性颅脑损伤后会发生不同程度的脑水肿，且水肿的程度和持续时间与继发性颅脑损伤的发生发展密切相关。最近有实验直接验证了水通道蛋白4（aquaporins—4，AQP4）参与了脑水肿的形成。Manley等在急性水中毒脑水肿模型中研究显示，AQP4在水肿模型的脑组织内高表达，而正常鼠脑AQP4低表达；研究者在缺血性脑水肿模型中，与正常组相比，应用基因敲除技术使AQP4在脑组织表达缺乏，结果发现，缺乏AQP4的大鼠生存能力强，持续大脑中动脉阻塞缺血后24h测定大脑半球肿胀百分率下降35％，临床结局明显改善，说明了AQP4参与脑水肿的形成，并在脑水肿中起重要作用。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是90年代初发现的存在于动植物细胞膜上具有高度选择性水孔道特异蛋白质家族，在水代谢的调节中起着重要作用。1994年利用水通道蛋白家族的同源性克隆技术分离出一种脑内水通道蛋白-AQP4。其基本结构同其他水通道蛋白一样，为分子量约30 kD的疏水性蛋白，每个单体包括6个跨膜倾斜的a-螺旋结构域及胞内的氨基和羧基端。这6个跨膜区由5个环连接（A-E）组成。B环及E环有高度保守的天冬酸氨—脯氨酸—丙氨酸（AsnPro-Ala，NPA）结构域。研究表明，6个跨膜区包绕着B环及E环形成一个筒状结构作为水分子通道。免疫组化发现，①AQP4蛋白在脑中的含量最高，分布于脑表面的软脑膜、导水管和脑室系统的室管膜、脉络丛，与脑脊液重吸收部位一致，脑脊液可通过其它细胞的AQP4重吸收；②星形胶质细胞，特别是靠近蛛网膜下腔、位于血管周围的星形胶质细胞表面上和星形胶质细胞的终足紧密包绕毛细血管壁形成的一层胶质界膜上也表达强烈，由于此界膜构成血脑屏障的第二道隔膜，起调节水运输的作用；③下丘脑视上核、室旁核和下丘脑的渴中枢，视上核和室旁核核团的神经大分泌细胞的牵张敏感性离子通道对细胞膨胀等容量变化十分敏感，渗透压改变1％即可发生反应，通过合成和释放抗利尿激素（AVP）调节肾脏水的排泄，推测AQP4可能是渗透压感受器或受体，通过加强对微小渗透压变化产生迅速而敏感的细胞容量改变，而在下丘脑调节渗透压；④海马的锥体细胞层、齿状回的颗粒细胞层和多形细胞层，分布在海马的AQP4目前其功能不明确。AQP4分布特点是胶质细胞与脑脊液以及血管之间水调节和运输的重要结构基础，与脑脊液重吸收、渗透压调节、脑水肿形成等生理、病理过程密切相关。但目前人们对颅脑损伤后脑水肿发生的具体病理生理学机制尚不清楚，关于AQP4在外伤性脑水肿中的作用，由于研究方法、手段以及观察时间的不同，结论并不一致，且大部分实验仍以动物为研究对象，病理状态下人体的研究很少。有些研究认为AQP4及其上调导致了外伤性脑水肿的形成。Sun发现自由落体致大鼠脑损伤24小时后，损伤区脑水肿程度最显著，AQP4的表达在损伤区肿胀的星形胶质细胞上明显上调，在周边临近区下调，在远处无明显变化，因此认为AQP4的上调可能是引起损伤区脑水肿的主要途径和原因。然而，还有一些学者研究认为发生脑水肿时，AQP4表达增加或减少是星形胶质细胞适应细胞外环境变化而做出的反应，是一种内源保护机制。Kiening等人观测到大鼠压缩气击致脑损伤模型中伤后24小时水肿最严重，而AQP4 mRNA表达随时间延长而降低，在损伤半球降低更为显著，因为此阶段以细胞性水肿为主，AQP4 mRNA下调可能减少了水在星形胶质细胞内的进一步积聚。本实验应用透射电镜对人体急性颅脑损伤后水肿脑组织进行超微结构观察，通过免疫组化的方法研究AQP4在人脑组织中的表达情况，更直接理解AQP4、血脑屏障在脑水肿发生中所产生的作用，为开发脑水肿形成阻断剂及寻找脑水肿靶向治疗提供理论依据，这对于急性颅脑损伤后脑水肿的防治，降低死亡率、致残率具有重要的临床价值。材料与方法：1．实验标本来源28例创伤组脑组织标本取自广州军区武汉总医院2006年3月至2006年9月急性颅脑损伤患者急诊行开颅清除血肿时所获挫伤周围脑组织，距发病时间2～24h。男性18例，女性10例，年龄15～60岁，平均年龄35.3岁，GSC评分3-10分，头颅CT提示为额叶、颞叶局部脑挫伤出血，中线结构移位明显。因正常脑组织难以取材，故取8例原发性癫痫病人病灶切除所获取的相对正常脑组织为正常对照，男性5例，女性3例，平均年龄23岁。2．应用常规HE染色、透射电镜对28例急性颅脑损伤患者挫伤周围脑组织形态及超微结构进行观察；应用免疫组化方法对水通道蛋白4（AQP4）在人脑组织中的表达情况进行研究。3．应用SPSS 10.0统计软件进行分析，取每张免疫组化染色切片上平均灰度值代表AQP4蛋白含量。灰度值高，表明该物质含量低，灰度值愈低，则表明该物质含量高。数据以均数±标准差（x±s）表示，并用SPSS统计软件两独立样本均数t检验进行统计分析，P＜0.01表示有显著性差异。结果：1．挫伤周围脑组织HE染色：光学显微镜下见脑组织疏松，细胞和血管周围空隙变大，血管厚薄不均，部分中断缺损，组织间广泛出血。2．透射电镜观察：挫伤周围脑组织毛细血管内皮细胞肿胀，血管内细胞的线粒体肿胀，嵴结构不清，血管腔狭窄，血脑屏障破坏明显，血管周围见“空泡样”变。脑组织细胞肿胀明显，胞浆呈空泡样改变，核周内质网扩大，线粒体肿胀，胞核固缩，核中染色质部分溶解，电子密度增高。3．免疫组织化学结果表明：正常对照组脑组织中AQP4可见少量表达，急性颅脑损伤后不久，AQP4表达即明显升高。（P＜0.001），主要表达在小血管及神经胶质细胞中。结论：1．急性颅脑损伤患者挫伤周围脑组织血脑屏障受损是脑水肿发生的形态学基础。2．实验研究表明AQP4蛋白主要表达于星形胶质细胞和微血管内皮细胞上，尤其富集于与毛细血管和软脑膜直接接触的胶质细胞的胞膜和胞浆中，与国外学者的研究结果基本一致。3．在人急性颅脑损伤后，脑组织中AQP4表达即明显升高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 1 一般资料
• 1.1 实验标本来源
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要溶液配制方法
• 2 实验方法
• 2.1 石蜡切片制备（用于AQP4免疫组织化学检测）
• 2.2 HE染色步骤
• 2.3 透射电镜样品的制备
• 2.4 免疫组织化学检侧
• 结果
• 讨论
• 展望
• 本章小结
• 论文综述:AQP4与血脑屏障及脑水肿关系研究进展
• 附录:在校期间发表的论文
• 致谢