论文摘要
牛奶及其乳清中含有大量乳糖，世界上70％～90％的亚洲和非洲人喝牛奶后会产生乳糖不耐症。乳糖不耐症在很大程度上限制了人们对乳及乳制品的摄入，会产生一系列不良影响。用β-半乳糖苷酶将牛奶中的乳糖水解，产生低乳糖牛奶，可以使乳糖不耐症得到缓解，并提高乳及乳制品的营养价值，同时去除了乳清浓缩时乳糖结晶析出给乳制品加工带来的不便。此外，用此水解物还可生产乳清饮料、糖浆、食品添加剂等。本研究旨在通过基因重组技术构建真核表达载体，使β-半乳糖苷酶基因在奶山羊乳腺上皮细胞中表达，并探索其不同时期的表达情况。目的在于进一步使β-半乳糖苷酶基因在奶牛乳腺中高水平表达，为今后制备转基因动物，生产转基因牛奶，改良牛奶品质提供可行的技术手段和可信的理论支持。另外，本研究所构建的真核表达载体含有报告基因lacZ的全部序列，其上游的调控序列两端带有限制性酶切位点，可为以后研究不同的真核基因调控序列提供方便可靠的模型。本研究从荷斯坦奶牛的乳腺组织中提取了基因组DNA，以此DNA为模板通过PCR技术克隆了牛αS1-酪蛋白基因的5’调控序列1195bp的片段。对此DNA片段进行序列测定，应用计算机软件DNAMAN6.0将它与GenBank发表的相应序列进行对比，发现同源率99.75％。应用基因重组技术在lacZ基因上游插入了获得的牛αS1-酪蛋白基因的5’调控序列，成功构建了真核表达载体gαslp-psv。用胶原酶消化法对奶山羊乳腺上皮细胞进行了分离培养，并用免疫荧光染色法测定了乳腺上皮细胞中角蛋白18的表达，从而鉴定出分离培养的细胞为奶山羊乳腺上皮细胞。用阳离子脂质体把载体gαslp-psv转入奶山羊乳腺上皮细胞，应用两种方法检测出β-半乳糖苷酶在奶山羊乳腺上皮细胞中获得表达。一种是细胞原位染色，β-半乳糖苷酶可以催化X-Gal分解，在普通光学显微镜下可以观察到培养细胞中生成深蓝色产物，因此可用于检测β-半乳糖苷酶在细胞中的表达。另一种方法是用Promega生产的Beta-Glo检测系统，检测转染后不同时期细胞培养液和细胞破碎液中的β-半乳糖苷酶的表达情况，从检测结果看出，在细胞培养液中，转染后24h可以检测到lacZ基因的表达，之后表达水平有逐渐升高的趋势，72h开始降低，144h降到最低；在细胞破碎液中，转染后24h表达水平最高，之后表达水平有逐渐降低的趋势，144h降到最低。实验证明，细胞表达的β-半乳糖苷酶为分泌性蛋白。转染细胞传代后的表达情况：转染细胞的第一代表达水平最高，之后随细胞传代表达水平降低，传到第三代时基本检测不到表达产物。