HLA-DR抗原及其等位基因与宫颈癌病因学的相关性研究

论文摘要

前言大量的研究已经证实感染高危型人乳头瘤病毒是宫颈癌发生的必要条件，但不到1％的感染者不能自发地清除HPV而形成持续感染并最终发展为宫颈癌。并且研究发现艾滋病患者及肾移植者更易持续感染HPV，这提示机体对病毒的的免疫应答对于宫颈癌的发病及其重要。人类白细胞抗原负责将外来抗原递呈给免疫细胞，在免疫识别和随后的清除病毒感染细胞的过程中起着关键性作用。由于HLA基因具有多态性，其编码产物的决定簇不同导致与抗原的亲和力不同，可能与宫颈癌易感性有关。本研究采用免疫组化的方法检测正常宫颈、CIN及宫颈癌组织中HLA-DR抗原、CD4分子及HPV16／18E6蛋白的表达，以探索宫颈局部的免疫状态在宫颈癌发病中的作用。同时运用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）试图寻找与宫颈癌易感性相关的基因。实验材料与方法一、序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）标本来源：收集我院妇产科手术切除的宫颈癌标本53例，正常宫颈34例，为同期因多发性子宫肌瘤行子宫全切除术的宫颈组织标本，术后均经病理检查证实。提取基因组DNA：石蜡标本经二甲苯脱蜡后采用酚-氯仿法提取基因组DNA。HPV DNA检测：采用HPV通用型引物（GP5+／6+）检测DNA样品中的HPV DNA。PCR反应体系于94℃预变性5 min；94℃35 s、40℃50 s、72℃45 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。同时设立阴性对照（不包含DNA模板，其余成分不变）。HLA-DRB1等位基因分型：参照Olerup，Zetterquist方法设计合成6对HLA-DRB1等位基因引物，运用序列特异性引物聚合酶链反应技术（PCR-SSP）每个样本进行6次PCR反应。PCR反应体系于94℃预变性5 min；94℃35 s、60℃45 s、72℃35 s，共36个循环，最后72℃延伸5 min。结果观察：PCR产物5μl与1ul GeneFinder核酸染料混合，于2.5％琼脂糖凝胶电泳，成像仪观察结果并摄像。二、免疫组化标本来源：收集中国医科大学附属盛京医院妇产科2002年～2004年的手术切除的石蜡标本，其中因多发性子宫肌瘤而行子宫全切的相对正常宫颈8例，CIN 15例、宫颈癌33例。术前均未经放化疗治疗，术后均经病理证实。实验方法：石蜡切片脱蜡至水，微波炉抗原热修复处理（检测HPV16／18E6蛋白时用胰蛋白酶消化抗原修复法），3％H2O2封闭内源性过氧化酶活性。10％山羊非免疫血清阻断非特异性结合。滴加一抗4℃孵育过夜，滴加生物素标记的二抗37℃5 min，滴加辣根酶标记链霉亲合37℃5min。DAB显色，苏木素核复染、脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。用厂家提供的染色阳性的切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为空白对照。免疫组化染色结果按照染色程度和阳性细胞百分比综合评分。统计学分析：采用SPSS11.5统计分析软件进行卡方检验，P＜0.05为有统计学意义。实验结果1、HPV DNA检测结果HPV DNA扩增产物片段长度为150 bp，53例宫颈癌组HPV DNA阳性率为75％（40／53），明显高于对照组的24％（8／34，P＜0.05）。2、HLA-DRB1等位基因分布频率宫颈癌组HLA-DRB1*1001、*11、*15等位基因的分布频率分别为36％、30％、43％，对照组分别为21％、15％、26％，两组分别比较，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；宫颈癌组HLA-DRB1*01、*13等位基因的分布频率分别为19％、51％，明显低于对照组（分别为47％、82％；P＜0.05）。HPV DNA阳性宫颈癌组织中HLA-DRB1*13等位基因的分布频率为40％（16／40），对照组为7／8，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。3、HLA-DR抗原的表达情况及与宫颈癌临床病理参数之间的关系HLA-DR抗原在正常宫颈、CIN及宫颈癌组织的阳性表达率分别为37.5％、73.3％、81.8％，呈逐渐增高，比较后，具有统计学意义，P＜0.05。分析HLA-DR抗原的表达与浸润性宫颈癌临床病理学特征之间的关系可见，临床分期越晚，分化程度越低，淋巴结转移，HLA-DR抗原的阳性表达率越高，但未见显著性差异，P＞0.05。4、CD4分子及HPV16／18E6蛋白的表达情况CD4分子在正常宫颈、CIN及宫颈癌组织的阳性表达率则分别为62.5％、40.0％、36.4％，呈现逐渐递减的趋势，但差异无显著性，P＞0.05。HPV16／18E6蛋白在正常宫颈、CIN及宫颈癌三组的阳性表达率逐渐增高，分别为37.5％、60.6％和75.8％，CIN组及宫颈癌组明显高于正常宫颈，P均＜0.05。结论1、HLA-DRB1等位基因在宫颈癌患者和正常人群的分布频率存在明显差异，HLA-DRB1*1001、*11、*15等位基因与宫颈癌正相关，可能是易感基因；HLA-DRB1*01、*13等位基因与宫颈癌负相关，可能是保护基因；HLA-DRB1*13可能具有对抗HPV的致癌作用。2．、宫颈癌细胞在外源性抗原HPV16／18 E6癌蛋白的刺激作用下表达HLA-DR抗原。异常表达HLA-DR抗原的癌细胞可能充当抗原递呈细胞，有助于增强机体的免疫应答。3、癌细胞HLA-DR抗原的表达增加但CD4+T细胞不能相应增加或缺失则不能增强机体的免疫应答。因此，宫颈癌的免疫治疗关键在于使免疫应答过程中的各成分比例及功能相互达到协调一致。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文一
• 前言
• 实验材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四、论文二
• 前言
• 实验材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 五、本研究创新性的自我评价
• 六、参考文献
• 七、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介