系统性红斑狼疮CD4+T细胞组蛋白修饰异常及SIRT1-siRNA对MRL-lpr/lpr狼疮鼠模型干预的研究

论文摘要

第一部分狼疮T细胞组蛋白修饰异常的研究第一节系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞组蛋白修饰异常的研究目的表观遗传学机制在人类疾病包括肿瘤、衰老和自身免疫病中扮演着重要角色。DNA甲基化,组蛋白修饰是表观遗传学修饰的主要方式,在基因调控中起重要作用。前期的研究发现系统性红斑狼疮（SLE）患者T细胞中基因组DNA及与自身免疫相关基因存在不同程度的低甲基化,本研究主要探讨SLE患者CD4+T细胞中核心组蛋白H3/H4乙酰化和H3K4/H3K9甲基化状态,组蛋白乙酰基转移酶（HATs）、组蛋白去乙酰基酶（HDACs）及组蛋白甲基转移酶（HMTs）表达水平以及对组蛋白乙酰化和甲基化状态的影响。方法20例系统性红斑狼疮患者均来自我院门诊,活动性患者10例,其中男1例,女9例,年龄14～41岁,平均年龄27.6±10.4岁,平均SLEDAI评分9.8±4.9分,非活动性患者10例,其中男2例,女8例,年龄15～58岁,平均年龄29.8±13.8,平均SLEDAI评分1.0±1.7分。正常对照组10例,男4例,女6例,年龄22～35岁,平均28.5±5.2岁,均为本院健康医务人员。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞,H3/H4乙酰化及H3K4/H3K9甲基化检测试剂盒检测H3/H4乙酰化和H3K4/H3K9甲基化水平,实时定量RT-PCR（real-time RT-PCR）法检测CD4+T细胞组蛋白乙酰基转移酶（HATs）-EP300,CREBBP和PCAF,组蛋白去乙酰化酶（HDACs）-HDAC1,HDAC2,HDAC4,HDAC5,HDAC7A和SIRT1,组蛋白甲基转移酶（HMTs）-SUV39H1、SUV39H2和EZH2基因mRNA表达水平。结果与正常对照组比较,活动性狼疮患者CD4+T细胞组蛋白H3/H4均呈低乙酰化状态（P=0.002,P=0.009）,且组蛋白H3乙酰化水平与疾病活动程度呈负相关（R=-0.889,P=0.044）,活动性和非活动性狼疮患者CD4+T细胞H3K9甲基化水平显著降低（P=0.001,P=0.003）,而H3K4甲基化水平无明显改变（P＞0.05）。此外,我们发现与正常对照组相比,活动性SLE患者CD4+T细胞SIRT1 mRNA表达水平明显增高（P＜0.001）,而CREBBP,P300,HDAC2,HDAC7,SUV39H2,EZH2 mRNA表达水平显著降低（P＜0.001,P＜0.001,P=0.01,P＜0.001,P=0.003,P=0.001）。非活动性SLE患者HDAC2,HDAC7,SUV39H2,EZH2 mRNA表达水平也显著降低（P=0.009,P＜0.001,P=0.04,P=0.001）。结论CD4+T细胞组蛋白修饰如核心组蛋白H3/H4低乙酰化和H3K9低甲基化可能在SLE发病中起重要作用。第二节MRL/lpr狼疮鼠CD4+T细胞组蛋白修饰酶谱的研究目的研究MRL/lpr狼疮鼠CD4+T细胞中组蛋白乙酰化酶（HATs）、去乙酰化酶（HDACs）、组蛋白甲基化酶（HATs）表达是否存在异常?方法SPF级18周龄MRL/lpr狼疮鼠10只,另10只野生型MRL/MPJ小鼠为正常对照组,实时定量RT-PCR（real-time RT-PCR）法检测CD4+T细胞组蛋白乙酰基转移酶（HATs）-EP300,CREBBP和PCAF,组蛋白去乙酰化酶（HDACs）-HDAC1,HDAC2,HDAC4,HDAC5,HDAC7和SIRT1,组蛋白甲基转移酶（HMTs）-SUV39H1、SUV39H2和EZH2基因mRNA表达水平,Western印迹检测SIRT1蛋白表达。结果与野生型MRL/MPJ小鼠相比,MRL-lpr/lpr狼疮鼠CD4+T细胞P300,PCAF,HDAC7,SUV39H2和EZH2 mRNA显著降低（P=0.04,P=0.04,P=0.04,P=0.03,P=0.01）,SIRT1 mRNA表达显著增高（P=0.04）。Western印记结果显示,MRL-lpr/lpr狼疮鼠CD4+T细胞SIRT1蛋白表达显著增高（P=0.01）,这些结果与系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞组蛋白修饰异常大体一致。结论狼疮鼠模型CD4+T细胞存在组蛋白乙酰化和甲基化修饰异常。第二部分SIRT1-siRNA对MRL/lpr狼疮鼠模型组蛋白修饰异常的干预及其治疗作用目的探讨SIRT1-siRNA对MRL/lpr狼疮鼠模型组蛋白修饰异常的干预及其治疗作用。方法SPF级18周龄雌性MRL/lpr小鼠,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,用免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞,小鼠分成四组,每组3只进行动物模型试验,①MRL/lpr小鼠+SIRT1-siRNA注射组;②MRL/lpr小鼠+Control-siRNA注射组;③MRL/lpr+生理盐水注射组;④MRL/lpr小鼠未处理组。每50ug化学合成siRNA溶解于1ml PBS中,注射至小鼠尾静脉中,8h和24h重复注射一次。所有注射均采用鼠尾静脉流体力学转染技术。24h、5d、10d后采集各组小鼠外周血分离CD4+T细胞,采用实时定量PCR及Western blot技术检测SIRT1 mRNA及蛋白水平,EpigentekTM试剂盒检测组蛋白H3、H4乙酰化水平,酶联免疫吸附法（ELISA）法检测抗dsDNA抗体和抗核抗体（ANA）,用尿蛋白试纸法检测尿蛋白水平,采用直接免疫荧光法及HE染色病理切片检测小鼠肾脏损害情况。结果1)与空白对照组比较,SIRT1-siRNA转染24h后小鼠CD4+T细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达水平下降（P=0.04,P=0.001）,5天后恢复基础水平。2)SIRT1-siRNA干预后24h组蛋白H3、H4乙酰化水平显著增高（P=0.02,P=0.01）,并一直持续到第5天（P=0.04,P=0.04）,干预后第10天组蛋白H4乙酰化水平仍较空白组显著增高（P=0.001）。3)SIRT1-siRNA干预后第10天抗dsDNA抗体水平明显降低（P=0.04）,抗核抗体（ANA）无明显改变（P＞0.05）。4)肾脏HE染色组织病理及免疫荧光结果显示SIRT1-siRNA干预后10天肾小管及血管病变均明显好转。同时,尿蛋白结果也较前好转。5)与空白对照组比较,Control-siRNA组及生理盐水干预组小鼠CD4+T细胞SIRT1基因mRNA及蛋白水平,组蛋白H3、H4乙酰化水平,以及抗dsDNA抗体,抗核抗体（ANA）滴度均无明显变化（P均＞0.05）,肾脏组织病理亦无明显改变。结论抑制去乙酰化酶SIRT1可在狼疮鼠体内纠正组蛋白低乙酰化状态,并有一定的治疗作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 论文正文
• 前言
• 第一部分 狼疮T细胞组蛋白修饰异常的研究
• 第一节 系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞组蛋白修饰异常的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 第二节 MRL/1pr狼疮鼠CD4+T细胞组蛋白修饰酶谱的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 SIRT1-siRNA对MRL/1pr狼疮鼠模型组蛋白修饰异常的干预及其治疗作用
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文及研究成果