草莓高效再生体系的建立和抗除草剂Bar基因工程菌的构建

论文摘要

本试验以适合安徽省栽培的草莓（Fragaria ananassa Duch）优良品种——丰香、鬼怒甘和章姬为试材,通过对茎尖增殖、叶片愈伤组织诱导、生根培养、移栽基质的筛选研究,建立起草莓简单、快速、高效的茎尖离体再生体系,为草莓转基因研究提供基础。再者,利用以LBA4404（pAL4404）、HB101（pRK2013）、DH5a（pBI121-bar）进行三亲杂交,为bar基因转化提供工程菌。另外,对草莓bar基因转化农杆菌侵染体系作了初步探索。试验研究获得的主要结果如下:1、草莓茎尖消毒不同处理的效果存在显著差异。其中,处理Ⅳ效果最好,成活率达到90%,与其他处理的差异达到了极显著水平。2、在茎尖培养中,当外植体大小＞0.7mm时,成活率高达95.6%,外植体＜0.3mm时成活率不到20%;外植体大小为0.3～0.5 mm、0.5～0.7 mm时,成活率分别达到了80%、84%。3、丰香、鬼怒甘及章姬的最佳增殖培养基分别为:MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.10mg/L、MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L、MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L。说明不同基因型的品种最佳增殖培养基存在差异。4、应用SPSS软件分析,得出诱导叶片愈伤组织的最佳培养基是:MS+BA 3.0mg/L+2,4-D 0.2 mg/L+IBA 0.3 mg/L。5、丰香、鬼怒甘、章姬生根的最适培养基分别为是:1/2MS+IBA 0.1 mg/L、1/2MS+IBA 0.0 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L。6、分步炼苗后移栽,发酵过的稻壳+菜园土（1:1）,成活率达到98%左右;其它配方成活率也到达了90%左右。7、利用三亲杂交法将真核表达载体pBI121-bar转入根癌农杆菌LBA4404,通过菌落PCR、质粒PCR、质粒双酶切电泳检测,证明工程菌构建成功。8、试验筛选出浓度为25 mg/L和20 mg/L的卡那霉素分别是草莓试管苗、叶片愈伤组织分化阶段的适宜选择压。9、对工程菌抑制抗生素浓度筛选,Cef与Carb有效抑菌浓度均为200 mg/L。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 英文缩略词
• 1 文献综述
• 1.1 草莓离体培养
• 1.1.1 花药培养
• 1.1.2 茎尖培养
• 1.1.3 叶片及匍匐茎的培养
• 1.2 抗除草剂转基因草莓研究进展
• 1.2.1 草莓的转基因研究现状
• 1.2.2 抗除草剂转基因草莓转化的主要方法
• 1.2.3 抗除草剂Bar基因遗传转化的检测和鉴定方法
• 1.2.4 抗除草剂转基因草莓研究存在的问题
• 1.2.5 抗除草剂转基因草莓研究的未来发展方向
• 2 引言
• 2.1 研究主要内容、目的和意义
• 2.2 技术路线
• 2.2.1 草莓高效离体再生体系
• 2.2.2 工程菌的构建
• 2.2.3 草莓遗传转化初步体系
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 茎尖培养材料
• 3.1.2 叶片培养材料
• 3.1.3 质粒与菌种
• 3.1.4 抗生素
• 3.1.5 培养基
• 3.1.6 PCR引物
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 草莓离体再生体系的建立
• 3.3.2 抗除草剂Bar基因工程菌的构建
• 3.3.3 草莓遗传转化初步体系
• 4 结果与分析
• 4.1 不同消毒处理对外植体的影响
• 4.2 不同大小的茎尖对形态发生能力的影响
• 4.3 不同草莓品种对增殖的影响
• 4.4 不同激素组合对茎尖增殖的影响
• 4.5 叶片诱导愈伤组织培养基
• 4.6 不同浓度IBA对生根的影响
• 4.7 草莓试管苗移植的方法及要点
• 4.8 真核表达载体pBI121-bar转化大肠杆菌DH5α
• 4.8.1 感受态细胞的转化
• 4.8.2 转化菌落PCR鉴定
• 4.9 真核表达载体pBI121-bar转化农杆菌LBA4404
• 4.9.1 转化工程菌菌落PCR
• 4.9.2 转化工程菌质粒PCR
• 4.9.3 转化工程菌质粒双酶切
• 4.10 工程菌株的构建
• 4.11 两种不同方法对质粒提取的比较
• 4.12 卡那霉素（Kan）筛选浓度的确定
• 4.13 抑制转化农杆菌LBA4404生长的Cef和Carb浓度确定
• 5 讨论
• 5.1 不同消毒处理对茎尖灭菌的影响
• 5.2 不同大小的茎尖对形态发生能力的影响
• 5.3 不同草莓品种对增殖的影响
• 5.4 不同激素组合对茎尖增殖的影响
• 5.5 不同浓度IBA对生根的影响
• 5.6 抗生素浓度的筛选
• 5.7 真核表达载体的转化农杆菌
• 5.8 草莓遗传转化体系的初步研究
• 6 结论
• 6.1 草莓高效再生体系的建立
• 6.2 抗除草剂Bar基因工程菌的构建
• 6.3 草莓选择压及工程菌抑制浓度的筛选
• 参考文献
• 附图表
• 附表1 不同草莓品种茎尖增殖倍数原始记录
• 附图1 草莓茎尖高效再生体系的建立
• 附图2 工程菌的构建
• 附图3 不同草莓品种增殖比较
• 附图4 生根培养基诱导生根情况
• 附图5 试管苗、叶片对卡那霉素浓度的筛选
• 附图6 草莓叶片诱导愈伤组织
• 附图7 转化工程菌检测
• 7-1 菌落PCR
• 7-2 质粒PCR
• 致谢
• 作者简介
• 在学期间发表的论著及科研成果清单