论文摘要
第一部分E-cadherin在前列腺癌组织中的表达及其与病理组织分化的关系[目的]探讨E-cadherin与前列腺癌病理分级的关系。[方法] （1）采用免疫组化方法检测前列腺癌组织芯片中29例前列腺癌和癌旁组织标本中E-cadherin的表达。（2）使用定量PCR和Western Blot方法检测前列腺癌细胞株PC-3和DU 145中E-cadherin蛋白的表达。[结果]（1）E-cadherin在前列腺癌标本中的阳性表达率为93.1%,在癌旁组织标本中的阳性表达率为100%；前列腺癌和癌旁组织中E-cadherin的表达率无显著差异（p＞0.05）；低分化前列腺癌标本中E-cadherin强阳性率为12.5%；中分化前列腺癌标本中为26.7%；高分化前列腺癌标本中强阳性率为50%,低分化组中E-cadherin强阳性率明显低于高分化组,差异具有统计学意义（p<0.05）；（2）定量PCR和Western blot方法检测发现E-cadherin在PC-3和DU145两个细胞株中都有表达,但在DU145中的表达水平明显比PC-3高。[结论]（1）前列腺癌中E-cadherin的表达率与癌旁组织无显著差别。（2）E-cadherin表达与前列腺癌的病理分级密切相关,提示E-cadherin的异常表达可能影响前列腺癌的进展及转移。第二部分转录水平上调E-cadherin表达的功能性dsRNA筛选[目的]为E-cadherin抑癌基因筛选出靶定位于其启动子区域并具有相对高效激活功能的dsRNAs分子。[方法] （1）分析E-cadherin基因序列情况（尤其是E-cadherin基因启动子区域的情况）,根据外文文献描述的siRNA的设计规则,在E-cadherin基因转录起始位点相关的5’侧翼序列的1kb区域上（避免高CpG区域）随机选择7个靶点序列并设计成7对候选dsRNA。对照dsRNA序列（dsControl）设计为与已知人基因组无序列同源性。（2）化学合成以上候选dsRNA并分别转染到PC-3和DU 145细胞内,每种细胞系中分别设置对照组（包括空转染MOCK组和对照dsRNA转染）和候选dsRNA组。（3）使用定量PCR方法检测候选dsRNA转染后E-cadherin基因的表达,根据基因的表达水平筛选出相对高效激活功能的dsRNAs分子（我们将相对高效激活功能的dsRNAs分子定义为在mRNA水平上上调E-cadherin基因表达2.5倍以上）。使用Western blotting方法进一步验证功能性激活dsRNA的作用效果。[结果]出乎我们意料,7对候选dsRNA中,有4对dsRNA具有下调E-cadherin的表达的功能,为功能性干扰dsRNA;其中1对dsRNA可以有效上调E-cadherin的表达,为功能性激活dsRNA;另外2对dsRNA对调节E-cadherin表达无明显效果。[结论]E-cadhein基因启动子区域同时存在着可以被dsRNA上调或下调的靶点序列,这些靶点序列具有序列特异性；基因启动子区域存在着可以被dsRNA调控的靶点可能是一个普遍现象,可能可以通过设计、合成、转染靶定位于基因启动子区域的dsRNA来调节基因的表达。第三部分功能性dsRNA转录水平调控E-cadherin表达的相关分子机制探讨[目的]探讨功能性dsRNA转录水平调控E-cadherin基因表达的相关分子作用机制。[方法]（1）使用激光共聚焦显微镜观察荧光Cy3标记的dsRNA在细胞内的定位情况；（2）设计基因特异性引物行RT-PCR检测E-cadherin启动子附近的正义链和反义链RNA转录本；（3）根据功能性dsRNA的序列设计出正义链和反义链碱基数目不相等的非对称小RNA（asymmetric small RNA,asRNA）,检测非对称小RNA调节E-cadherin基因表达的效果,从而推断出功能性dsRNA中哪一条链是真正发挥基因调节功能的真正引导链以及相应靶标链；（4）分别构建Ago-1和Ago-2基因稳定沉默的细胞株,在以上两种细胞模型中分别转染功能性dsRNA并检测转染后E-cadherin基因的表达变化情况,从而明确Ago-1和Ago-2蛋白是否在功能性dsRNA调控基因表达过程中发挥作用。[结果]（1）功能性dsRNA可以进入细胞核内发挥作用；（2）E-cadherin启动子区域存在着内源性非编码RNA正义链和反义链转录本,这些非编码RNA转录本很可能是介导功能性dsRNA转录水平调控E-cadherin表达的作用平台；（3）小激活RNA（dsE-661,dsE-640和dsE-215）的反义链为引导链,而与引导链相互配对的E-cadherin启动子区域的DNA正义链或者启动子区域的非编码RNA正义链转录本很可能为小激活RNA的靶标序列；（4）小干扰RNA（dsE-604）的正义链为引导链,而与引导链相互配对的E-cadherin启动子区域的DNA反义链或者启动子区域的非编码RNA反义链转录本很可能为小干扰RNA的靶标序列；（5）Ago-2在功能性dsRNA介导的基因转录水平调控中发挥决定性作用,激光共聚焦显微镜结果显示Ago-2主要表达定位在细胞浆中提示了Ago-2可能在dsRNA进入细胞浆中加工递呈发挥作用；而主要表达定位在细胞核中的Ago-1在小干扰RNA介导的基因转录水平沉默中起着决定性作用。[结论]（1）功能性dsRNA可以进入细胞核内发挥作用；（2）E-cadherin基因启动子区域的非编码RNA转录本很可能是介导功能性dsRNA转录水平调控E-cadherin表达的作用平台；（3）小激活RNA（dsE-661,dsE-640和dsE-215）和小干扰RNA（dsE-604）的引导链和靶标序列完全相反,导致其功能活性也完全相反；（4）Ago-2在功能性dsRNA介导的基因转录水平调控中发挥决定性作用,而主要表达定位在细胞核中的Ago-1在小干扰RNA介导的基因转录水平沉默中起着决定性作用。第四部分非对称小激活RNA上调E-cadherin对前列腺癌细胞的治疗作用及相关分子机制探讨一、aaE-217上调E-cadherin对前列腺癌细胞的治疗作用[目的]通过体外实验检测非对称小激活RNA（aaE-217）上调E-cadherin以后对前列腺癌细胞PC-3的增殖、凋亡、克隆形成、转移和侵袭等生物学行为的影响,从而初步评价非对称小激活RNA对前列腺癌细胞的治疗作用。[方法]（1）首先根据本课题第三部分结论将以往文献报道的靶定位于E-cadherin启动子区域的小激活RNA（dsE-217）设计成正义链和反义链（为17/19的结构）碱基数不相等的非对称小RNA——aaE-217;（2）然后将aaE-217转染入PC-3细胞中,检测aaE-217对E-cadherin的激活效果。对照组设置为只加转染试剂lipo2000的空转染组（Mock）和转染与人类基因组无序列同源性的dsRNA组（dsControl）;（3）采用WST-1细胞增殖试剂盒和肿瘤克隆形成实验方法检测aaE-217转染后PC-3细胞增殖生长情况；使用ANNEXIN V-FITC细胞凋亡检测试剂盒评估转染后前列腺癌细胞的凋亡情况；采用划痕实验和Transwell实验检测aaE-217转染后前列腺癌细胞迁移和侵袭能力的改变。[结果]（1）细胞增殖实验和克隆形成实验结果显示aaE-217上调E-cadherin的表达的同时,可以明显抑制前列腺癌细胞PC-3生长；流式细胞仪检测显示aaE-217转染72h后,总的凋亡细胞（即早期凋亡细胞（LR）加上晚期凋亡细胞（UR））所占比例为14.6%；而对照Mock组和dsControl组的总凋亡细胞所占比例分别为8.56%和7.75%；与对照组相比,aaE-217可以显著增加PC-3细胞的凋亡诱导；（2）细胞划痕实验显示aaE-217处理组与同时间点的对照组相比,细胞未覆盖面积明显较大；Transwell实验检测显示aaE-217转染72h后,PC-3细胞穿过人工基底膜的细胞数（68.9±8.8）明显少于dsControl组的穿膜细胞数（186.2±12.3）。[结论]体外实验表明,aaE-217上调E-cadherin的同时,可以有效抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖,增加诱导肿瘤细胞的凋亡、以及明显抑制肿瘤细胞的转移和侵袭能力。二、aaE-217上调E-cadherin表达抑制前列腺癌细胞生物学行为的相关分子机制探讨[目的]探讨aaE-217上调E-cadherin表达抑制前列腺癌细胞的增殖、转移和侵袭能力的相关分子机制。[方法]（1）采用Werstern blot实验方法检测aaE-217干预后,P53、Cleaved-PARP、MMP2、MMP7等基因的表达情况；采用Elisa实验方法检测aaE-217转染后前列腺癌细胞株PC-3分泌到细胞培养基中的uPA、IL-6、MMP2、MMP7和OPN等相关因子的表达水平；（2）采用Western blot和细胞免疫荧光方法检测β-catenin在细胞内分布的变化情况。[结果]（1）Western Blot结果发现aaE-217干预后,PC-3细胞中的P53、Cleaved-PARP表达水平明显增高；（2）Elisa检测发现aaE-217转染PC-3细胞后,细胞培养基中uPA、IL-6、MMP2、MMP7和OPN等肿瘤转移侵袭因子的分泌都相应下降。而Western Blot进一步证实aaE-217干预后PC-3细胞中MMP2和MMP7表达下降。（3）Western blot和细胞免疫荧光实验结果表明,aaE-217转染后,β-catenin从细胞浆、细胞核中聚集分布到细胞膜上。[结论]aaE-217上调E-cadherin表达可能促进β-catenin出核,聚集结合到细胞膜上,从而减少作为转录因子的β-catenin在细胞核内的表达分布,上调凋亡诱导相关蛋白分子、下调肿瘤细胞转移和侵袭相关因子的表达,进而发挥诱导前列腺癌肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,阻遏肿瘤细胞转移和侵袭等作用。