论文摘要
第一部分:CD133免疫磁珠分选脐血内皮祖细胞的培养及鉴定目的建立具备高效增殖、血管生成与迁移能力的脐血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）分离培养鉴定方法。方法应用免疫磁珠分选纯化脐血单个核细胞中的CD133+细胞,体外EGM-2MV培养液培养扩增,通过形态学、细胞表面标志及功能鉴定EPCs,并与脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）作比较。结果EPCs分离培养7d左右开始出现小集落,21d左右,集落扩大,相互融合,并呈现出典型铺路石样改变;培养14d左右免疫荧光Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双阳性,CD133和CD34阳性率呈明显迅速下降,而CD31阳性率呈明显迅速上升;在增殖、血管生成与迁移能力比较上,EPCs优于HUVECs。结论通过CD133免疫磁珠分选脐血单个核细胞,可培养出具有高效增殖、血管生成与迁移能力的EPCs。第二部分:胶质瘤诱导内皮祖细胞血管新生的机制初探目的初步探讨内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）参与胶质瘤血管新生的机制。方法通过U87胶质瘤细胞培养上清作用于EPCs,观察EPCs体外血管形成以及迁移能力,并检测VEGFR-1、VEGFR-2与MMP-9的表达。VEGFR-2 siRNA转染EPCs,观察对EPCs参与血管新生的影响,检测VEGFR-2、MMP-9、Akt和ERK的表达。结果U87胶质瘤细胞培养上清能诱导EPCs血管新生;U87胶质瘤细胞培养上清上调EPCs VEGFR-2与MMP-9的表达,而VEGFR-1的表达基本不变。VEGFR-2 siRNA特异性下调EPCsVEGFR-2的表达,未影响VEGFR-1的表达;VEGFR-2 siRNA有效抑制EPCs体外血管形成及迁移能力;VEGFR-2 siRNA能抑制EPCsMMP-9的表达与活性,以及Akt与ERK的磷酸化水平。结论胶质瘤细胞通过上调EPCs VEGFR-2调控MMP-9、Akt和ERK的表达,从而诱导EPCs参与其血管新生。第三部分:HSV-TK转染的内皮祖细胞的靶向血管新生治疗胶质瘤体内外实验目的以内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）为载体,探讨转染HSV-TK的EPCs,靶向血管新生治疗胶质瘤体内外治疗作用。方法重组腺病毒Ad.CMV-tk转染EPCs后,经GCV作用,观察其敏感性;将转染HSV-TK的EPCs和U87与U251胶质瘤细胞、脐静脉内皮细胞,以不同比例混合,经GCV作用,以MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测凋亡。将转染HSV-TK的EPCs经尾静脉注入裸鼠皮下胶质瘤模型,观察各组肿瘤体积的变化,免疫组化检测各组中血管情况。结果转染HSV-TK的EPCs的存活率,随着GCV的浓度增加而逐渐下降。转染HSV-TK的EPCs对胶质瘤细胞与血管内皮细胞的旁观者效应,呈现时间依赖性与细胞比例依赖性。静脉注射转染Ad.CMV-tk后的EPCs,对裸鼠皮下胶质瘤生长具有明显抑制作用,并抑制血管生成。结论HSV-TK转染的EPCs可通过靶向血管新生来抑制胶质瘤生长。
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