论文摘要
【背景】人核糖体蛋白S13（RPS13）基因位于染色体11P15.1-14,全长约3.3Kb,有6个外显子和5个内含子。RPS13是细胞内蛋白质翻译小体-核糖体小亚基上重要的结构蛋白之一,属于核糖体蛋白S15P蛋白家族,主要定位于细胞浆内。广泛分布于脑、甲状腺、肺、心、乳腺、胃、肝、肾、结肠、胎盘、前列腺和皮肤等组织,在骨髓和胰腺中高表达。在蛋白质翻译过程的多个阶段,RPS13在调节核糖体大小亚基间相互作用中起非常重要的作用。研究还证实RPS13蛋白在生长活跃的细胞、结肠癌和非小细胞肺癌中高表达。我们前期的研究发现RPS13在胃癌耐药细胞中表达显著高于胃癌细胞,进一步研究发现RPS13可能是通过抑制药物诱导细胞凋亡而促进胃癌细胞多药耐药。RT-PCR结果表明RPS13在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织,提示RPS13在胃癌的发生发展中可能发挥重要的作用。既往的研究表明,核糖体蛋白在肿瘤发生发展的过程中发挥了重要的作用。很多核糖体蛋白,如RPS6、RRPL15和RPS3a等都与肿瘤的发生发展密切相关。然而,人核糖体蛋白RPS13在胃癌中的表达如何,是否与胃癌的发生发展有关尚不清楚,本课题将对此进行深入探讨。【目的】1、RPS13的原核表达,纯化及其多克隆抗体的制备;2、探讨RPS13在胃癌组织和细胞中的表达及亚细胞定位; 3、研究RPS13在胃癌发生发展中可能的作用。【方法】1、构建RPS13原核表达载体并转化入E. coli,IPTG诱导RPS13融合蛋白的表达;2、以固化Ni2+柱纯化目的蛋白;3、以融合目的蛋白为抗原免疫小鼠制备RPS13抗血清;4、RT-PCR方法和Western blot方法分别检测RPS13在胃癌细胞系MKN28、AGS、SGC7901、MKN45及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR和胃粘膜永生化细胞GES-1中的表达情况;5、免疫细胞化学方法证实RPS13在胃癌细胞SGC7901和SGC7901/VCR中的表达和亚细胞定位;6、免疫组织化学观察RPS13在胃癌组织和非肿瘤胃粘膜组织中的表达情况,并分析RPS13的表达与胃癌临床病理资料的关系;7、构建RPS13的正义真核表达载体和siRNA载体,脂质体法转染SGC7901细胞,G418筛选并获得稳定克隆;8、Western blot方法鉴定不同载体的转染效果;9、MTT法绘制细胞生长曲线;10、流式细胞仪分析转染细胞的凋亡情况和周期分布;11、平板克隆形成实验观察细胞在体外的克隆形成能力;12、裸鼠成瘤实验观察RPS13对胃癌细胞体内的成瘤能力的影响;13、Western blot检测转染细胞中经典周期相关分子（Cyclin D1及Cyclin B）的表达。【结果】1、RPS13的原核表达,纯化及其多克隆抗体的制备（1）成功表达了RPS13融合蛋白;（2）用固化Ni2+亲和层析法得到了纯度很高的融合蛋白;（3）制备了特异性较高的抗RPS13多克隆抗体;2、探讨RPS13在胃癌组织和细胞中的表达（1）RPS13在胃癌细胞系MKN45、SGC7901、MKN28和AGS中的表达高于正常胃粘膜永生化细胞GES-1,在耐药细胞SGC7901/VCR中的表达高于其亲本细胞系;（2）RPS13在胃癌细胞SGC7901中主要分布于胞浆内;（3）RPS13在61例胃癌原发灶癌细胞的胞浆中表达,其阳性率74% （45/61）明显高于非肿瘤胃粘膜组织42% （10/24）,这一结果提示RPS13在胃癌组织中高表达（p<0.05）。（4）发现胃癌组织中RPS13的过表达与患者年龄、性别和肿瘤的分化程度、TNM分期及淋巴结的转移均无相关（p>0.05）。3、研究RPS13参与胃癌发生中可能的作用（1）构建了RPS13真核正义表达载体和siRNA载体,将其分别转染胃癌细胞SGC7901,G418筛选获得稳定表达的混合克隆,Western blot检测证实成功建立了RPS13上调和下调的稳定细胞亚系。（2）用MTT法检测细胞生长情况,结果发现RPS13表达上调使细胞生长加快;而下调RPS13的胃癌细胞生长减慢。（3）细胞周期检测结果显示,RPS13上调的细胞增殖指数增加,G1/S期的转换加快;siRPS13转染的细胞增殖指数减小,并出现G1期阻滞。（4）药物诱导细胞凋亡率检测显示,RPS13过表达细胞凋亡率明显下降,siRPS13转染的细胞凋亡率上升。（5）平板克隆试验显示,RPS13正义转染细胞生长加快,克隆形成率显著高于对照组;siRNA抑制RPS13表达的细胞生长减慢,克隆形成率低于转染空载体的细胞。（6）Western blot检测经典的周期相关分子发现,RPS13上调/下调的细胞中Cyclin D1分子和Cyclin B的表达均无明显变化。【结论】（1）RPS13在胃癌组织和多种胃癌细胞系中过表达,提示它参与胃癌发生发展。（2）RPS13上调可促进胃癌的恶性表型:促进胃癌细胞的生长和成瘤性,可抑制药物诱导的胃癌细胞凋亡;相反,RPS13下调能抑制胃癌细胞的生长增殖,促进胃癌细胞的凋亡。（3）RPS13可能通过参与调节细胞凋亡、细胞周期等多种途径影响胃癌细胞恶性生物学行为,仍需进一步的探索其分子机制。