蚓激酶基因F238在毕赤酵母和枯草芽孢杆菌中的表达

论文摘要

本论文利用毕赤酵母高拷贝质粒和大肠-枯草芽孢杆菌穿梭质粒,将外源基因蚓激酶F238分别克隆至毕赤酵母和枯草芽孢杆菌中进行表达,并对工程菌的培养条件进行了优化。主要研究结果如下：应用PCR技术扩增获得蚓激酶F238成熟肽基因,分别将其克隆至毕赤酵母和枯草芽孢杆菌表达载体pPIC3.5K和pPBE2R中,构建了两个表达载体：pPIC3.5K-F238、pPBE2R-F238。毕赤酵母GS115表达蚓激酶的研究。将重组质粒pPIC3.5K-F238线性化后用电穿孔方法转入Pichia pastoris GS115中,首先筛选出his+MutS表型转化子,再用不同浓度的G418抗生素选择耐高抗性菌株。本研究获得1株耐3mg/mLG418的阳性重组菌株,经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE电泳检测异源表达产物相对分子量为2.8×104Da,与预期值相符,采用纤维蛋白平板法检测目的蛋白酶活为257.6U/mL。枯草芽孢杆菌WB600表达蚓激酶的研究。重组质粒pPBE2R-F238采用化学转化方法导入Bacillus subtilis WB600中,SDS-PAGE电泳检验发酵液中外源表达产物相对分子量为2.8×104Da,与蚓激酶分子量大小一致；纤维蛋白原平板检测结果证明具有纤溶活性213.7U/mL。对工程菌的发酵培养基和发酵条件进行优化,结果为：接种种龄18h的菌液至含40mL培养基的250mL三角瓶中,pH7.0、37℃下培养22h,最终酶活达到593.5U/mL。培养基以20g/L玉米粉、10g/L豆饼粉、0.4g/L氯化钾、0.1g/L硫酸镁、0.3g/L氯化钙、0.05g/L氯化铁组成。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 前言
• 1.1 蚓激酶的研究背景
• 1.1.1 蚓激酶溶栓作用概述
• 1.1.2 蚓激酶的结构特征
• 1.1.3 蚓激酶生理学特征
• 1.1.4 蚓激酶的基因工程研究
• 1.1.5 蚓激酶的临床应用进展
• 1.2 毕赤酵母表达系统研究进展
• 1.2.1 毕赤酵母表达系统的优越性
• 1.2.2 毕赤酵母的质粒载体
• 1.2.3 毕赤酵母表达宿主菌
• 1.2.4 影响外源蛋白表达的因素
• 1.3 枯草芽孢杆菌表达系统简介
• 1.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统的优势
• 1.3.2 枯草芽孢杆菌的质粒载体
• 1.3.3 枯草芽孢杆菌宿主菌及应用
• 1.3.4 枯草杆菌表达系统存在问题
• 1.4 本题的立题依据及实验内容
• 1.4.1 立体依据
• 1.4.2 内容及技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 相关溶液
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 抗生素
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 蚓激酶在毕赤酵母中的表达
• 2.2.1 蚓激酶基因F238的克隆
• 2.2.2 表达载体pPIC3.5K-F238的构建
• 2.2.3 重组质粒的转化及转化子的筛选
• 2.2.4 酵母工程菌株的诱导表达
• 2.2.5 重组蚓激酶的活性测定
• 2.3 蚓激酶在枯草芽孢杆菌中的表达
• 2.3.1 重组质粒pBE2R-F238的构建
• 2.3.2 SDS-PAGE检测
• 2.3.3 重组蚓激酶的活性测定
• 2.3.4 质粒稳定性的检验
• 2.3.5 工程菌发酵培养基及发酵条件的优化
• 3 结果与讨论
• 3.1 蚓激酶在毕赤酵母中的表达
• 3.1.1 在毕赤酵母中表达的蚓激酶基因的扩增
• 3.1.2 重组质粒pPIC3.5K-F238的构建
• 3.1.3 重组质粒的转化及转化子的筛选
• 3.1.4 转化子表型的鉴定
• 3.1.5 耐高高浓度G418工程菌株的筛选
• 3.1.6 酵母工程菌株的诱导表达
• 3.1.7 SDS-PAGE电泳检测表达产物
• 3.1.8 重组蚓激酶的活性测定
• 3.2 蚓激酶在枯草芽孢杆菌中的表达
• 3.2.1 在枯草芽孢杆菌中表达的蚓激酶基因的扩增
• 3.2.2 重组质粒pBE2R-F238的构建
• 3.2.3 枯草芽孢杆菌化转感受态的制备及转化
• 3.2.4 转化子的筛选及鉴定
• 3.2.5 SDS-PAGE检测目的蛋白
• 3.2.6 蚓激酶的活性测定
• 3.2.7 质粒稳定性的检验
• 3.3 工程菌培养基的优化
• 3.3.1 工程菌生长曲线的测定
• 3.3.2 不同碳源对产酶的影响
• 3.3.3 碳源添加量对工程菌产酶的影响
• 3.3.4 不同氮源对工程菌产酶的影响
• 3.3.5 氮源浓度对工程菌产酶的影响
• 3.3.6 无机盐正交试验
• 3.4 工程菌培养条件的优化
• 3.4.1 种龄对酶活的影响
• 3.4.2 pH值对酶活的影响
• 3.4.3 培养温度对酶活的影响
• 3.4.4 装液量对酶活的影响
• 3.4.5 培养时间对枯草杆菌产酶的影响
• 3.5 优化结果的验证
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢