短尾蝮蛇毒解离素的分离纯化及活性测定

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解离素是一类含有精-甘-天冬氨酸（RGD）序列或赖-甘-天冬氨酸（KGD）序列的小分子多肽,因含有RGD 或KGD 而能抑制依赖此识别位点的整合素与其配体结合,从而抑制血小板聚集、血管新生和肿瘤转移等。本文拟从江浙产短尾蝮（Gloydius brevicaudus）蛇毒中分离解离素,并测定其部分理化性质及生物学活性,为开发利用提供实验依据。1. 解离素的分离纯化及部分理化性质测定应用Superdex 75 分子筛色谱,从江浙短尾蝮蛇粗毒中分离得到6 个蛋白峰;其中蛋白峰Ⅳ可抑制二磷酸腺苷（ADP）诱导的血小板聚集且分子量小于10kDa,初步鉴定为解离素组分。该组分再通过Sephadex G-25 凝胶过滤、DEAE SepharoseFast Flow 离子交换色谱和Lichrospher C18 反相色谱纯化得一个解离素纯品,暂定名为GbvⅣ4。GbvⅣ4 在SDS-PAGE（Tris-Tricine 系统）凝胶电泳中,呈单一蛋白条带,通过凝胶成像系统软件计算其分子量为8746 道尔顿;采用聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳测定其等电点为6.3。自动电位滴定法测定磷脂酶A2 活力和Rick方法测定蛋白酶活力,结果均为0。2. GbvⅣ4 对血小板聚集的影响采用经典的Born 法,测定GbvⅣ4 对ADP、凝血酶诱导的血小板聚集的影响。结果显示,GbvⅣ4 对ADP 和凝血酶诱导的血小板聚集均有抑制作用,且呈明显的量效关系,其半数抑制浓度(IC50)分别为0.22μg/ml 和1.327μg/ml。3. GbvⅣ4 对人胃癌细胞株（SGC-7901）生长的影响采用SRB 法观察GbvⅣ4 对胃癌细胞株SGC-7901 增殖的抑制作用。结果发现GbvⅣ4 可抑制SGC-7901 细胞的生长,且随药物浓度增加,抑制作用亦增强,但随时间增加抑制作用增强不明显。Gbv Ⅳ4作用24h 对于SGC-7901细胞的IC50为71.68μg/ml。

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前言

Ⅰ. 解离素的分离纯化及理化性质测定

1. 材料

2. 方法

2.1 短尾蝮蛇毒的分子筛色谱

2.2 分离组分对血小板聚集的影响

2.3 解离素的纯化

2.3.1 凝胶过滤层析

2.3.2 离子交换层析

2.3.3 反向层析

2.4 解离素的理化性质测定

2.4.1 浓度测定

2.4.2 纯度鉴定

2.4.3 分子量测定

2.4.4 等电点测定

2.4.5 蛋白酶活力测定

2.4.6 磷脂酶A2活力测定

3. 结果

4. 讨论

Ⅱ. 解离素的活性测定

1. 材料

2. 方法

2.1 解离素对血小板聚集的影响

2.2 解离素对体外培养肿瘤细胞生长的影响

2.3 解离素对内皮细胞生长的影响

2.4 解离素对鸡胚尿囊膜血管生成的影响

3.结果

4.讨论

Ⅲ. 结论

参考文献

致谢

综述

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