自噬在巨噬细胞清除凋亡细胞中的作用

论文摘要

目的研究巨噬细胞吞噬凋亡细胞后自噬结构的形态学特征,探讨自噬对于巨噬细胞清除凋亡细胞的作用,以及自噬与异噬的相互关系。方法用环磷酰胺分别诱导淋巴细胞和Jurkat细胞凋亡。将凋亡的淋巴细胞和Jurkat细胞加入巨噬细胞培养皿,计算凋亡细胞清除率。通过Giesma染色和扫描电镜观察巨噬细胞吞噬凋亡细胞的表面结构变化,透射电镜下观察巨噬细胞吞噬凋亡细胞后自噬前体、自噬体、自噬溶酶体和两性体的分布和结构特点,用图像分析仪测量自噬结构与细胞质的断面面积,求出面积之比。用MDC染色法标记巨噬细胞的自噬体,在激光共聚焦扫描显微镜下观察和计数。用3-MA抑制巨噬细胞的自噬,观察凋亡细胞被清除变化。结果巨噬细胞活跃地吞噬凋亡细胞、凋亡细胞核、凋亡小体或其他细胞碎片,形成异噬体。与对照组比较,吞噬凋亡细胞组的巨噬细胞发生自噬的细胞增多,巨噬细胞内自噬体数目增多,自噬前体、自噬体和自噬溶酶体与细胞质的断面面积之比增大。许多自噬体内可见凋亡小体或其他细胞碎片,这些自噬体的体积较大,多位于细胞膜下。亦可见内含细胞质样物质、损伤线粒体或内质网等的自噬体,多位于线粒体和粗面内质网附近。未观察到含有整个凋亡细胞或凋亡细胞核的自噬体。在部分细胞出现吞噬体和自噬体融合而成的两性体。两性体内含凋亡细胞碎片和完整自噬体内膜结构。当巨噬细胞自噬受抑制时,凋亡细胞清除率降低。结论巨噬细胞清除凋亡细胞时自噬功能显著增强。自噬对于凋亡细胞的清除起着重要的直接和间接作用。在凋亡细胞清除时,自噬途径和异噬途径可通过两性体的形成发生密切联系。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
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• 前言
• 第一部分 自噬在凋亡淋巴细胞清除中的作用
• 材料和方法
• 1 实验动物
• 2 仪器和试剂
• 2.1 仪器
• 2.2 试剂
• 3 细胞培养
• 3.1 巨噬细胞的分离和培养
• 3.2 淋巴细胞的分离和培养
• 4 淋巴细胞凋亡实验
• 4.1 诱导淋巴细胞凋亡
• 4.2 凋亡细胞的鉴定与检测
• 4.2.1 AO/EB染色
• 4.2.2 Hoechst33258染色
• 5 巨噬细胞吞噬凋亡淋巴细胞实验
• 6 巨噬细胞吞噬凋亡淋巴细胞后的电镜观察
• 6.1 扫描电镜标本制备
• 6.2 透射电镜标本制备
• 6.3 自噬结构的图像分析
• 7 MDC染色
• 结果
• 1 凋亡淋巴细胞的形态学特征
• 2 巨噬细胞吞噬凋亡淋巴细胞的形态特征
• 3 巨噬细胞吞噬凋亡淋巴细胞后自噬体数目变化
• 4 自噬结构的超微结构特征
• 讨论
• 第二部分 凋亡肿瘤细胞清除过程中异噬与自噬的关系
• 材料和方法
• 1 实验动物
• 2 仪器和试剂
• 2.1 仪器
• 2.2 试剂
• 3 细胞培养
• 3.1 巨噬细胞的分离和培养
• 3.2 Jurkat细胞复苏和培养
• 4 Jurkat细胞凋亡实验
• 4.1 诱导Jurkat细胞凋亡
• 4.2 凋亡细胞的鉴定与检测
• 4.2.1 AO/EB染色
• 4.2.2 Hoechst33258染色
• 5 巨噬细胞吞噬凋亡Jurkat细胞实验
• 6 巨噬细胞吞噬凋亡Jurkat细胞后的电镜观察
• 6.1 扫描电镜标本制备
• 6.2 透射电镜标本制备
• 7 MDC染色
• 结果
• 1 凋亡Jurkat细胞的形态学特征
• 2 巨噬细胞吞噬凋亡Jurkat细胞的形态特征
• 3 巨噬细胞吞噬凋亡Jurkat细胞后自噬变化
• 4 自噬体和两性体超微结构特征
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 文献综述
• 在读期间发表论文
• 致谢