柳树AP3同源基因的克隆与表达分析

论文摘要

AP3基因在植物的花发育过程中具有重要作用，作为“ABC”模型的B类基因，AP3或PI与AG的作用决定雄蕊的特征。根据已知的杨树AP3同源基因PTD的保守区序列设计引物，以垂柳、黄花柳、黄枝白柳、杞柳、绵毛柳及簸箕柳总DNA为模板，均扩增出了大小约2.1K左右的片段。根据簸箕柳DNA测序结果设计引物，利用RT-PCR技术及5’RACE、3’RACE技术，获得了簸箕柳中AP3同源基因的全长cDNA序列。该基因cDNA全长为826bp，编码241个氨基酸，预测分子量大小为28kDa。 根据基因组扩增片断测序结果以及簸箕柳SSMADS基因全长aDNA序列，预测出垂柳、黄花柳、黄枝白柳、杞柳、绵毛柳中AP3同源基因的全长cDNA。分析表明，本实验所克隆的柳属植物AP3同源基因，在核苷酸水平和氨基酸水平均有很高的相似性，分别为95％-98.7％和95.2％-99.6％，虽然它们在序列上各有差异，但全部具有AP3基因所特有的保守区域，说明该基因在柳属植物中具有较好的保守性。 通过实时定量RT-PCR分析，发现SSMADS基因主要在簸箕柳花器官中表达，在根、茎、叶中虽然有少量表达，但表达量很低。在花器官发育的不同阶段，SSMADS基因表达量也不同，在花发育的早期阶段，其表达量较低，随着花器官的发育，其表达量有所增加，然后随着花器官的成熟表达量又降低。 将水稻AP3同源基因OsMADS16的RNAi植物表达载体转入农杆菌，用叶盘法转化烟草，得到95株潮霉素抗性芽。当芽长到1.5cmc以上时，移入附加有hygromycin 50mg／L的MS培养基上，大部分植株在20天左右都能正常生根。对22株转基因抗性植株进行检测，18株为PCR阳性。转基因烟草在转化前后花器官的表型变化尚在观察之中。烟草转化的成功为进行簸箕柳的转化奠定了一定的技术基础。 以簸箕柳当年春季萌生的新枝条为外植体，建立了其植株再生体系。探讨了基本培养基和不同组合的激素对丛生芽诱导的影响，结果表明不同基本培养基对丛生芽的诱导无太大影响，而BA为1.0mg／L、NM为0.01mg／L时，丛生芽诱导率达到了最大，为100％；平均诱导芽数为3个／株；芽的生长状况也较好。当丛生芽长到3cm左右时，切下，在不加激素的White或B5两种基本培养基诱导其生根，生根率可达90％以上。簸箕柳组培再生体系的建立为进一步用转基因方法验证簸箕柳AP3同源基因的功能提供了技术平台。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 RNA干扰及其在功能基因组学中的应用
• 1 植物花发育概述
• 2 植物成花基因研究进展
• 2.1 植物的开花决定
• 2.2 花的发端
• 2.3 MADS盒基因与花器官的发育
• 2.3.1 MADS盒基因及其编码的蛋白转录因子的结构和表达特点
• 2.3.2 ABC模型及其发展
• 2.3.3 花发育调控基因的结构特点
• 2.3.4 A功能基因
• 2.3.5 B功能基因
• 2.3.6 C功能基因
• 2.3.7 D功能基因
• 2.3.8 E功能基因
• 2.3.9 单子叶植物与双子叶植物花器官结构的比较
• 3 植物MADS盒基因的克隆
• 4 讨论
• 第二章 RNA干扰及其在功能基因组学中的应用
• 1 前言
• 2 RNA干扰及其作用机制
• 2.1 RNA干扰的发现
• 2.2 RNAi的特点
• 2.3 RNAi的作用机制
• 2.4 RNAi的生物学功能
• 2.4.1 防止病毒感染
• 2.4.2 维持基因组中转座子的稳定
• 2.4.3 清除异常RNA
• 2.4.4 基因表达调控
• 3 功能基因组学研究的主要内容和研究方法
• 3.1 功能基因组学的几个概念
• 3.1.1 基因组
• 3.1.2 基因组学
• 3.1.3 结构基因组学
• 3.1.4 比较基因组学
• 3.1.5 功能基因组学
• 3.2 功能基因组学研究的主要内容
• 3.2.1 基因功能的研究
• 3.2.2 基因组的表达及时空调控的研究
• 3.2.3 蛋白质组及蛋白质组学
• 3.2.4 基因组多样性的研究
• 3.2.5 模式生物体基因组研究
• 3.3 功能基因组学研究中常用的方法
• 3.3.1 基因剔除
• 3.3.2 转基因研究
• 3.3.3 基因诱变及突变体的PCR筛选
• 3.3.4 表达谱基因芯片
• 3.3.5 RNA干涉
• 3.3.6 表达序列标签
• 3.3.7 基因表达的系列分析
• 3.3.8 蛋白质组学
• 3.3.9 生物信息学（bioinformatics）
• 4 RNA干扰在功能基因组学中的应用
• 4.1 在动物功能基因组研究中的应用
• 4.2 在植物功能基因组研究中的应用
• 5 RNA干扰存在的问题
• 6 讨论
• 7 本论文的选题依据
• 第三章 柳树AP3同源基因的克隆及表达分析
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种及质粒
• 2.1.3 酶与主要试剂
• 2.1.4 培养基配方
• 2.1.5 仪器与设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 植物总DNA的提取
• 2.2.2 PCR扩增
• 2.2.3 PCR产物的纯化回收
• 2.2.4 回收产物与T载体的连接
• 2.2.5 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.6 重组载体转化大肠杆菌
• 2.2.7 转化子的检测鉴定
• 2.2.8 序列测定
• 2.2.9 序列分析
• 2.2.10 簸箕柳AP3同源基因正反义植物表达载体的构建
• 2.2.11 总RNA的提取
• 2.2.12 逆转录合成cDNA
• 2.2.13 PCR扩增簸箕柳中AP3同源基因cDNA片段
• 2.2.14 簸箕柳AP3同源基因cDNA全长的克隆
• 2.2.15 进化树分析
• 2.2.16 实时定量RT-PCR分析
• 2.2.17 验证管家基因的特异性
• 2.2.18 从管家基因中选取合适的内对照基因
• 3 结果与分析
• 3.1 柳树AP3同源基因DNA片段的克隆与分析
• 3.1.1 柳树总DNA的提取
• 3.1.2 PCR扩增
• 3.1.3 PCR产物的克隆
• 3.1.4 柳树AP3同源基因序列的测定与分析
• 3.1.5 簸箕柳AP3同源基因SSMADS基因正反义植物表达载体的构建
• 3.2 柳树AP3同源基因cDNA的克隆与分析
• 3.2.1 簸箕柳总RNA的提取
• 3.2.2 簸箕柳AP3同源基因cDNA片段的克隆与分析
• 3.2.3 簸箕柳AP3同源基因全长cDNA的克隆与分析
• 3.2.4 柳属植物AP3同源基因全长cDNA的克隆与分析
• 3.3 簸箕柳AP3同源基因SSMADS与其他植物AP3同源基因的比对
• 3.4 簸箕柳AP3同源基因SSMADS的表达分析
• 4 讨论
• 第四章 转OsMADS16基因研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物受体材料
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 质粒和菌株
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 仪器与设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 液氮冻融法转化农杆菌
• 2.2.3 烟草遗传转化
• 2.2.4 潮霉素抗性植株的分子检测
• 2.2.5 转基因植物的移栽
• 3 结果与分析
• 3.1 液氮冻融法转化农杆菌LBA4404
• 3.2 转OsMADS16基因的潮霉素抗性植株的获得
• 3.3 转OsMADS16基因植株的分子检测
• 3.3.1 潮霉素抗性植株检菌
• 3.3.2 潮霉素抗性植株的PCR检测
• 3.4 转OsMADS16基因植株的形态观察
• 4 讨论
• 第五章 簸箕柳组织培养初探
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 材料的处理
• 2.2.2 初代接种
• 2.2.3 培养基和培养条件
• 3 结果与分析
• 3.1 外植体的选择
• 3.2 不同消毒处理对外植体初代培养的影响
• 3.3 增殖培养基的筛选
• 3.3.1 基本培养基对丛生芽诱导的影响
• 3.3.2 不同激素组合对丛生芽诱导的影响
• 3.4 生根诱导
• 4 讨论
• 第六章 主要结论
• 1. 主要结论
• 2. 研究的创新点及意义
• 3. 存在问题和展望
• 附录
• 参考文献
• 详细摘要