温度对病毒介导的RNA沉默的影响及转基因植株病毒抗性的传导

论文摘要

RNA沉默是一种依赖核酸序列特异性的抗病毒防御机制,而针对寄主的这种防御机制,许多病毒演化出RNA沉默抑制子以克服这种防御反应,两者在互作过程中存在动态的协同进化现象,同时也受到一些环境因素的影响。以病毒核酸片段为转基因而诱导的基因沉默不但将转基因的转录产物降解,而且能将入侵的与转基因具有同源性的病毒基因组RNA降解,这种病毒抗性称为RNA介导的病毒抗性(RMVR),这种策略具有抗病程度高、抗性持久、生物安全性高等特点。本研究的主要内容包括:设定温度梯度研究温度对植物体与病毒互作的影响;利用非翻译的PVX 25KD运动蛋白基因转化烟草,得到不同抗性的转基因植株,研究RNA介导病毒抗性发生几率及其传导规律。具体结果如下:1. RNA沉默介导的植物抗病毒防御反应具有温度依赖性特点,在心叶烟上的试验表明,对于PVX和PVY N,激发RNA介导病毒抗性,发生症状减轻直至消失的临界温度均为30℃,此温度下处理12天后,感病心叶烟植株发生了恢复现象,上部新生展开叶片呈现完全健康状态,下部已感病叶片症状不变。低于这一临界温度,感病心叶烟持续发病,而高于这一临界温度,感病心叶烟发生恢复现象的时间缩短。2.高温能够激活RNA沉默介导的植物抗病毒防御反应,产生大量siRNA。在较低温度时,由病毒激发的RNA沉默会受到抑制,病毒起源的siRNA含量极少,甚至检测不到,植株易感病。当温度达到30℃甚至更高时,感病植株下部症状保持叶片中,病毒起源的siRNA含量明显增加,而上部新生健康叶片中却检测不到siRNA。3.转基因植株的抗病性分析表明,在转化非翻译PVX 25KD的72株T0代烟草植株中得到高抗的转基因植株33株,抗性比例为45.8%。4.转化非翻译PVX 25KD运动蛋白基因的转基因植株Northern blot分析表明,转基因在RNA水平上得到了表达,抗病性与转基因mRNA的累积量之间呈负相关,符合RNA介导抗病性的特点。5.单嫁接实验表明,PVX介导的抗病性信号不能从高度抗病砧木传到上部转基因感病接穗或未转基因的接穗中,与上部未转基因接穗相比,转基因感病接穗能延迟两周时间发病。6.双嫁接实验表明,PVX病毒不能跨越一段高度抗病植株的茎传递到未转基因的接穗中而引起症状,中部高度抗病植株也不产生症状,ELISA检测均为阴性。关于嫁接结果有待于进一步研究分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 RNA 沉默介导的病毒抗性
• 1.1.1 生物界RNA 沉默现象的发现
• 1.1.2 RNA 沉默的机制
• 1.1.3 RNA 沉默的重要特征
• 1.1.4 参与RNA 沉默的细胞组分
• 1.1.5 温度对于RNA 沉默的影响
• 1.2 植物中RNA 沉默的病毒抑制
• 1.2.1 植物编码的沉默抑制子的发现
• 1.2.2 植物编码的沉默抑制子的特点
• 1.2.3 植物病毒运动蛋白与RNA 沉默
• 1.2.4 病毒沉默抑制子的应用
• 1.3 本研究的立题依据和主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 病毒毒源
• 2.1.3 PCR 引物
• 2.1.4 菌株
• 2.1.5 各种生化试剂
• 2.1.6 常用缓冲液及培养基的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植株材料的处理
• 2.2.2 病毒蛋白含量的ELISA 检测
• 2.2.3 小分子RNA 的NORTHERN BLOT 检测
• 2.2.3.1 小分子RNA 的分离提取及电泳检测
• 2.2.3.2 小分子RNA 的电泳
• 2.2.3.3 转膜及烘膜
• 2.2.3.4 探针的合成
• 2.2.3.5 预杂交及杂交
• 2.2.4 农杆菌介导转化烟草
• 2.2.5 转基因植株的PCR 检测
• 2.2.6 转基因植株的NORTHERN BLOT 检测
• 2.2.6.1 植物总RNA 的提取
• 2.2.6.2 在含有甲醛的凝胶上进行RNA 电泳
• 2.2.6.3 转膜及烘膜
• 2.2.6.4 探针的合成
• 2.2.6.5 预杂交及杂交
• 2.2.7 检测抗性传导的嫁接试验
• 3 结果与分析
• 3.1 温度对病毒侵染引起的RNA 沉默的影响
• 3.1.1 不同温度处理植株感病症状
• 3.1.2 不同温度处理植株体内病毒蛋白含量变化
• 3.1.3 临界温度植株体内小分子RNA 的NORTHERN BLOT 分析
• 3.2 RNA 沉默介导病毒抗性的传导
• 3.2.1 非翻译的马铃薯X 病毒25KD 运动蛋白转基因植株的获得
• 3.2.1.1 转基因植株的获得
• 3.2.1.2 PCR 鉴定
• 3.2.1.3 PVX 抗病性鉴定
• 3.2.2 转基因MRNA 表达与抗病性的关系
• 3.2.3 RNA 介导的病毒抗性传导
• 3.2.3.1 利用单嫁接研究RNA 介导抗性在不同抗病型植株间的传导
• 3.2.3.2 利用双嫁接研究病毒在RNA 介导的抗性植株中的传播
• 4 讨论
• 4.1 温度对于病毒诱导的RNA 沉默的影响
• 4.2 转基因MRNA 表达与抗病性
• 4.3 RNA 介导抗性的传导
• 4.4 病毒在RNA 介导的高度抗病植株中的传送
• 5 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ 常用缓冲液及培养基的配制
• 附录Ⅱ 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 致谢
• 硕士研究生阶段发表的综述及论文