论文摘要
第一部分编码人GIRK4基因的shRNA序列筛选及腺病毒表达载体的构建实验一:人GIRK4的shRNA真核表达载体质粒构建目的:构建编码人GIRK4的shRNA真核表达载体质粒,为利用基因沉默技术从转录后水平进行GIRK4的研究做准备。方法:根据人GIRK4序列设计并合成四组shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGCsi-U6,并进行PCR鉴定和测序。结果:PCR证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与与设计的相同,获得人GIRK4的shRNA表达载体质粒（pGCsi-GIRK4-shRNA-U6）。结论:构建的GIRK4的shRNA真核表达载体可进入哺乳动物细胞内表达短发夹RNA,经Dicer酶裂解成siRNA并降解靶基因mRNA,而达到基因干扰的作用,为利用其进行GIRK4功能研究奠定了基础。实验二:人GIRK4的真核表达载体质粒构建目的:构建编码人GIRK4真核表达载体质粒,为进行人GIRK4的shRNA序列的筛选作准备。方法:以购买的人GIRK4基因为模板,PCR其cDNA编码序列并克隆进入载体pEGFP-C1,并进行PCR鉴定、测序及转染293细胞在荧光显微镜下观察。结果:PCR证明cDNA已插入载体,经测序证明与与设计的相同,获得人GIRK4融合蛋白的表达载体质粒（pEGFP-GIRK4-C1）,并能转染293细胞表达融合蛋白。结论:构建的人GIRK4真核表达载体可进入哺乳细胞内表达GIRK4-EGFP融合蛋白,为进行针对GIRK4基因RNA干涉序列筛选打下基础。实验三:人GIRK4基因RNA干涉序列的筛选目的: RNA干扰是基因技术的重要进展,人们可以在转录后水平减少基因的表达。对RNAi是否有效而言,基因靶序列的选择是至关重要的因素。我们研究了外源表达系统中（HEK293 cell）GIRK4-shRNA沉默GIRK4基因表达的有效性及选择高效的干涉序列。方法:将已构建的四个靶向GIRK4基因的不同区域GIRK4的shRNA表达载体质粒（pGCsi-GIRK4-shRNA-U6）、对照质粒分别与与人GIRK4的真核表达载体质粒（pEGFP-GIRK4-C1）共转染HEK293细胞,收集转染后48h的细胞,进行Western blotting检测。结果:转染48小时之后,与对照组相比,四个不同序列的shRNA表达载体质粒（pGCsi-GIRK4-shRNA-U6）使GIRK4蛋白表达在48小时分别减少78.1%、85.3%、88.3%、94.3%,其中以4#载体序列是最有效的干涉序列,其序列为:GGCTGAGCAGAATGAAGAA。结论:成功地在外源表达系统筛选出高效的针对人GIRK4基因的高效RNA干涉序列。实验四:重组腺病毒载体Ad-GIRK4-shRNA的构建及鉴定目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建重组腺病毒载体Ad-GIRK4-shRNA并在293细胞中扩增制备重组腺病毒载体。方法:人工合成针对GIRK4的4#高效干涉序列,将其克隆到pDC316-EGFP-U6载体中,将pDC316-GIRK4-shRNA-EGFP-U6载体和骨架病毒pBHGloxE1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,并进行PCR鉴定和测序。结果:经PCR鉴定和测序,证实成功地构建了携带人GIRK4的4#高效干涉序列重组腺病毒载体（Ad-GIRK4-shRNA）并制备出高滴度重组病毒。结论:成功地构建了携带人GIRK4 shRNA片段的重组腺病毒载体（Ad-GIRK4-shRNA）,为进一步进行GIRK4的研究奠定了基础。第二部分人心房肌细胞培养目的:培养出一定数量和具有良好状态的人心房肌细胞。方法:联合运用Ⅰ型胶原酶和ⅩⅣ型蛋白酶消化人右心耳的标本,并利用差速贴壁法消除大部分非心肌细胞,并利用actin抗体进行免疫组化鉴定。结果:成功培养出一定数量人心房肌细胞,经actin抗体鉴定90%以上均为心肌细胞。结论:成功培养出人心房肌细胞,为今后进行下一步实验打下了基础。第三部分腺病毒介导的Ad-GIRK4-shRNA对人心房肌细胞GIRK4干涉的实验研究目的和背景:心房颤动是临床上最常见的心律失常之一,其与迷走神经系统密切相关;心脏迷走神经通过释放的乙酰胆碱,作用于心房M2受体-G蛋白-IKACh通路,激活IKACh。GIRK4是IKACh的功能亚单位,基因敲除的GIRK4小鼠不能诱发房颤。本实验通过将腺病毒介导的GIRK4 shRNA导入人心房肌细胞,观察在人心房肌细胞进行RNA干涉GIRK4的问题、可行性及对迷走神经通路上的GIRK1、M2AChR表达及IKACh电流密度的影响,为今后将RNA干涉技术引入心律失常机制的研究及基因治疗提供新思路和初步经验。方法:将重组腺病毒载体Ad-GIRK4-shRNA转染培养的人心房肌细胞,收集转染后不同时间的细胞,利用RT-PCR、蛋白印迹来检测GIRK4、GIRK1、M2AChR的表达及用全细胞膜片钳技术来检测IKACh、IK1电流密度的变化。结果:Ad-GIRK4-shRNA在MOI20对人心房肌细胞转染效率即达到95%以上;在mRNA水平和蛋白水平降低了GIRK4的表达,呈现出剂量依赖性和时间依赖性: MOI为5,20,50时,Ad-GIRK4-shRNA干涉效率分别为15.1%,35.2%, 51.1%（P<0.05）;与空病毒感染组相比较, Ad-GIRK4-shRNA感染人心房肌细胞后GIRK4 mRNA表达水平分别为在24h、48h、96h分别为50.9%、14.7%、98.1%。Ads-GIRK4-shRNA在mRNA水平和蛋白水平分别使GIRK1表达降低了27.9%,20.2%（P<0.05）;使M2AChR的表达增加了19.6%,18.6%（P<0.05）。Ad-GIRK4-shRNA对IK1的电流密度无影响（P>0.05）,使IKACh的电流密度下降了53%（P<0.05）。结论:Ad-GIRK4-shRNA在mRNA和蛋白水平降低了GIRK4的表达,说明在人心房肌细胞进行RNA干涉GIRK4是可行的,但存在许多需解决的问题;GIRK4的表达下降进而导致GIRK1、M2AChR的表达的变化,IKACh的电流密度下降,表明GIRK4在心房M2受体-G蛋白-IKACh通路和IKACh通道中处于一个重要的地位,干涉GIRK4的表达具有潜在的治疗效应。