茯苓抗肿瘤细胞多药耐药性有效成分及作用研究

论文摘要

茯苓为多孔菌科真菌Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核。性味甘,淡,平,归人心脾肺经。具有祛湿利水、健脾和胃、宁心安神的作用,临床常用于治疗小便不利,水肿胀满,痰饮咳逆,呕秽,泄泻,遗精,淋浊,惊悸,健忘等,其主要有效成分为茯苓多糖和三萜类化合物。国内外许多学者都对茯苓进行了广泛的研究,实验证明茯苓具有抗炎、抗肿瘤、增强免疫等多种功能。本实验室曾对100种常用中药的乙醇提取物进行过抗肿瘤细胞多药耐药性的活性筛选,经过筛选发现茯苓、山豆根、功劳木等九种常见中药的乙醇提取物具有逆转KBV200细胞多药耐药性的活性,因此,本实验选择茯苓为研究对象,对茯苓的乙醇提取物进行进一步研究,为茯苓进一步的开发利用提供一定的实验依据。本课题对茯苓乙醇提取物中化学成分的研究主要包括以下几个方面: 1)本课题对茯苓乙醇提取物进行了进一步的分离纯化,茯苓粉碎晾干后,用95%的乙醇加热提取两次,合并两次的提取液,旋蒸浓缩得到乙醇浸膏。茯苓乙醇浸膏加水混悬后,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取。采用薄层分析及制备、硅胶柱层析、葡聚糖凝胶分离、高效液相分析及制备等方法进行分离纯化,并利用各种理化性质和波谱技术鉴定茯苓乙醇提取物中的化学成分。从茯苓的乙醇提取物中分离得到8个茯苓三萜类化合物,经结构鉴定依次为3?–羟基-羊毛甾-7,9（11）,24-三烯-21-酸（化合物5）、猪苓酸C（化合物8）、16a-羟基-3,4-开环-羊毛甾-4（28）,7,9（11）,24（31）-四烯-3,21-二酸-3-甲酯（化合物1）、16a-羟基-3,4-开环-羊毛甾-4（28）,7,9（11）,24（31）-四烯-3,21-二酸（化合物2）、去氢土莫酸（化合物3）、16a-羟基-3,4-开环-羊毛甾-4（28）,7,9（11）,24-四烯-3,21-二酸-3-甲酯（化合物4）、16a-羟基-3,4-开环-羊毛甾-4（28）,7,9（11）,24-四烯-3,21-二酸（化合物7）和茯苓酸（化合物6）。2)利用MTT法（四唑蓝比色法）检测检测从茯苓中分离得到的8个化合物对人口腔癌耐药细胞KBV200的细胞毒作用,分别测定化合物浓度为3.125μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和200μg/ml时,各化合物对KBV200的细胞毒作用。实验发现浓度在12.5μg/ml以下时,化合物对KBV200细胞无细胞毒作用,而高于50μg/ml时,化合物则对KBV200具有一定的细胞毒作用。3)利用MTT法检测不同浓度的VCR（长春新碱）分别与12.5μg/ml和25μg/ml的各化合物联用时对KBV200细胞多药耐药性的逆转作用。酶标仪检测不同浓度的茯苓三萜类成分与不同浓度的长春新碱合用时KBV200细胞的吸光度值（OD值）,计算细胞的存活率,并绘制随药物（VCR）浓度变化的细胞生长曲线;计算出该药的半数抑制浓度IC50和各化合物的逆转倍数。通过实验检测和对逆转倍数的计算,发现8个化合物均有一定的抗肿瘤细胞多药耐药性的作用,其中去氢土莫酸的效果最好,其逆转倍数可以达到23.3。由于去氢土莫酸是茯苓乙醇提取物中的主要化学成分,并且具有很好的抗肿瘤细胞多药耐药的活性,因此,我们选择去氢土莫酸作为我们下一步的研究对象。4)利用流式细胞仪技术检测去氢土莫酸对细胞内P-糖蛋白表达的影响、通过罗丹明123的累积和外排实验检测去氢土莫酸对P-糖蛋白功能的影响,并通过流式细胞仪技术检测去氢土莫酸对长春新碱引起的细胞凋亡的作用。结果表明当去氢土莫酸虽然并未影响细胞内P-糖蛋白的表达,但它能够显著增加Rh123在细胞内的残留量,并且当其增加至25μg/ml时,也可以显著增加Rh123在细胞内的累积量,即去氢土莫酸能增加了细胞内抗癌药物的浓度,并且当去氢土莫酸与VCR联用时可以促进KBV200细胞的凋亡。茯苓作为我国的传统中药,有着悠久的栽培历史和药用历史,且我国有着丰富的茯苓茯苓资源,本论文为茯苓在抗肿瘤细胞多药耐药性方面的应用提供了实验依据,有利于茯苓的进一步开发利用。

论文目录

• 缩略语索引
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 茯苓的研究概况
• 1.1 茯苓三萜类化学成分及其药理作用
• 1.2 茯苓其他类化学成分及其药理作用
• 2 抗肿瘤细胞多药耐药性的研究进展
• 2.1 肿瘤多药耐药性的机制
• 2.2 逆转肿瘤多药耐药性的研究
• 3 本课题的研究目的和研究方法
• 第二章 茯苓乙醇提取物分离纯化及结构鉴定
• 2.1 仪器与材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 茯苓乙醇提取物的制备及萃取
• 2.2.2 氯仿层的化合物分离纯化
• 2.2.3 乙酸乙酯层的化合物分离纯化
• 2.2.4 化合物纯度检测
• 2.3 化合物的结构鉴定
• 2.4 讨论
• 第三章 茯苓三萜类化合物抗肿瘤细胞MDR 活性研究
• 3.1 仪器与材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 溶液的配制
• 3.2.2 细胞培养
• 3.2.3 茯苓三萜类化合物对KBV200 细胞株的细胞毒作用剂量筛选
• 3.2.4 茯苓三萜类化合物抗KBV200 细胞多药耐药活性的测定
• 3.2.5 化合物3 逆转肿瘤细胞MDR 的作用研究
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 茯苓三萜类化合物对KBV200 细胞毒作用的剂量筛选
• 3.3.2 八个茯苓三萜类化合物抗KBV200 细胞多药耐药活性的测定
• 3.3.4 化合物3 逆转KBV200 细胞MDR 的作用研究
• 1)化合物3 对KBV200 细胞凋亡的影响
• 2)化合物3 对P-糖蛋白功能的影响
• 3)化合物3 对细胞内P-gp 表达的影响
• 第四章总结
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢