pYBA植物表达双元载体构建与构巢曲霉alcM启动子在拟南芥中功能验证

论文摘要

在农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的植物遗传转化中,常常需要用到植物表达双元载体。为了便于基因工程操作并能在获得转基因植物后方便将标记基因删除,本试验构建了植物表达双元载体pYBA载体系列,以满足用于生产安全转基因植物的需要。本研究通过融合PCR方法,尽可能去除所有非必需的序列,将pYBA载体最小化。pYBA载体在大肠杆菌中为多拷贝,骨架为3.69kb。试验中构建的含NptⅡ植物筛选标记基因的载体pYBA100为5.37kb,含Hyg植物筛选标记基因的载体pYBA200为5.60kb,含Bar植物筛选标记基因的载体pYBA300为5.12kb,pYBA系列载体共同含有的多克隆位点为22个,方便基因工程操作。pYBA载体系列T-DNA区的植物筛选基因表达框两侧预留有LoxP-FRT融合位点,方便在获得转基因植物后通过ere或FLP重组酶将植物筛选标记基因删除。pYBA载体能于大肠杆菌和农杆菌中自我复制,并成功转化了拟南芥（Arabidopsis thaliana）,符合农杆菌介导的植物转基因要求。pYBA100载体离体删除试验结果证明,pYBA载体系列能经Cre重组酶删除植物标记基因表达框。目前广泛应用的乙醇诱导的alc表达系统,主要为AlcR/alcA诱导表达系统。为了获得具有自主知识产权的新型乙醇诱导系统,开发更加有效的并可以严格从时间和空间上控制目的基因表达的乙醇诱导系统。本试验从构巢曲霉菌基因组中克隆a1CM（SM）启动子全长,构建了含alcR基因的pBBB-AlcR-SM双元表达载体。利用农杆菌介导的花序浸染法转入拟南芥,并通过GUS染色验证原始的未加任何修饰的SM启动子的功能。GUS染色乙醇诱导的阳性苗,阳性苗基本全株呈蓝色,而相应未经诱导处理的阳性苗经GUS染色后根部可见少量蓝色。SM启动子在拟南芥中受乙醇诱导调控下游基因表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物双元表达载体的组成、构建机制和研究进展
• 1.1.1 植物双元表达载体的组成及构建机制
• 1.1.2 植物双元载体构建的研究基础及进展
• 1.2 位点特异性重组系统及融合PCR技术
• 1.2.1 位点特异性重组系统
• 1.2.2 载体构建技术-融合PCR
• 1.3 真核生物启动子结构概况
• 1.4 基于AlcR的alc乙醇诱导系统
• 1.5 本试验的研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料、菌株、载体、酶和试剂
• 2.2 pYBA双元载体的构建
• 2.2.1 载体骨架的构建
• 2.2.2 LoxP-FRT融合位点和多克隆位点MCS的添加
• 2.2.3 植物选择标记基因的改造
• 2.2.4 植物筛选标记基因表达框的构建
• 2.2.5 新双元载体pYBA系列的离体删除验证
• 2.2.6 拟南芥的转化与鉴定
• 2.3 基于AlcR的alcM乙醇诱导系统的构建
• 2.3.1 报告基因gus的插入和alcM（SM）启动子的克隆
• 2.3.2 SM启动子序列分析
• 2.3.3 含转录调节基因AlcR表达框的pBBBast-SMGR载体构建
• 2.3.4 pBBBast-SMGR载体的拟南芥转化及转基因阳性苗筛选检测
• 2.3.5 转基因植株的GUS鉴定
• 2.3.6 GUS诱导表达的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 pYBA双元载体
• 3.1.1 pYBA载体骨架的构建
• 3.1.2 LoxP-FRT融合位点、MCS和植物筛选标记基因表达框的添加
• 3.1.3 pYBA载体系列的离体删除鉴定
• 3.1.4 pYBA载体系列的植物转化与鉴定
• 3.2 基于AlcR的SM醇诱导系统
• 3.2.1 SM启动子及序列分析
• 3.2.2 基于AlcR的SM醇诱导系统的构建
• 3.2.3 pBBBast-SMGR转基因植株筛选及PCR检测
• 3.2.4 转基因植株的GUS鉴定
• 3.2.5 GUS诱导表达检测
• 4 讨论
• 4.1 pYBA新双元载体系列
• 4.2 源于构巢曲霉的SM启动子
• 4.3 基于AlcR的SM醇诱导系统
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介