论文摘要
自从上世纪50年代中期发现核糖体是蛋白质合成的必需结构之后，关于核糖体的结构、功能、生物合成及其调控等方面的深入研究就已经被广泛开展。由于一些历史原因，这些研究特别是关于核糖体结构与功能关系的研究大多数都是在大肠杆菌中进行的。在大多数细菌中rRNA操纵元是多拷贝的，因此rRNA基因的不同拷贝之间的差异和rRNA在核糖体功能中的作用成为了研究的热点。利用λRed同源重组系统，在Escherichia coli BW25113和DH5α染色体上进行了16s rRNA基因部分敲除，获得多株重组子。另外，在Selwyn Quan赠送的菌株SQ88（一株染色体上的五个rRNA操纵元被敲除的大肠杆菌菌株）的基础上，运用λRed同源重组系统，通过卡那霉素抗性基因筛选重组子，并利用抗性基因两端的FRT位点通过位点专一性重组将抗性基因去除，最终成功构建了一株仅具有单拷贝rRNA操纵元的E．coli菌株SQ88C。研究发现此菌株生长未受影响，其生长速率和rRNA／蛋白比值与出发菌株SQ88相比变化不明显，从而证明了单拷贝rRNA操纵元在一定条件下能够满足大肠杆菌正常生长的需要。这说明在E．coli中，不同rRNA操纵元之间即使存在差异，它们也肯定是很小的，并且在标准培养条件下对菌株生长影响不大。这为下一步的实验提供了很好的材料和理论依据。E．coli菌株SQ110染色体上仅剩一个拷贝的rrn操纵元，通过λRed同源重组敲除最后一个拷贝的rrn操纵元上16S rRNA基因的同时导入Bacillus subtilis 16S rRNA基因，获得一株具有Kan抗性的重组子SQ110BSP。菌株SQ110BSP可在非诱导培养基上生长，在消除质粒pBBRMCSP16后，得到的菌株SQ110BSX仍可生长。16S rDNA扩增结果显示外源16S rRNA基因已经导入大肠杆菌中。生长速率和rRNA╱蛋白比值显示菌株SQ110BSX中核糖体效率与SQ110相比大幅下降，且SQ110BSX表现出冷敏感特性。这表明B．subtilis的16S rRNA基因可以与E．coli 23S rRNA、5S rRNA和r-蛋白形成杂合核糖体，但核糖体的效率明显下降且核糖体装配受到一定程度的影响。以SQ110为出发菌株敲除16S rRNA基因，通过λRed同源重组，获得一株具有Kan抗性的重组子SQ25。菌株SQ25可在非诱导培养基上生长，在消除质粒pBBRMCSP16后，得到的菌株SQ25X仍可生长。各项验证表明Kan抗性基因上下游序列与预计相符，但SEFA-PCR和亚克隆建库结果都证实异常重组的发生。另外，以菌株SQ171为出发菌株，将质粒pKKSma-Cm-A-1替换SQ171中的质粒pKK3535后，得到的菌株SQ171-Cm-3和4在未加入诱导剂时仍可生长，质粒pKKCm酶切分析和PCR扩增都证实了质粒间重排的发生。无论在敲除还是质粒替换过程中都较易出现质粒重排等异常重组事件，这是可能是由于在上述两个菌株中敲除和质粒替换对细胞都是有害的，从而使得异常重组以较高频率发生。
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