论文题目: 双重组菌耦合不对称还原生产（R）-或（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化工
作者: 敬科举
导师: 岑沛霖,徐志南
关键词: 不对称还原,氯乙酰乙酸乙酯,醛基还原酶,重组菌,氯羟基丁酸乙酯,葡萄糖脱氢酶,重组菌,双菌耦合,辅酶再生,动力学,重组菌
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 手性化合物由于其特殊的生物活性,已经在医药、农药、材料、香精香料及昆虫信息素和激素等方面得到广泛的应用。近年来,用手性技术不对称催化合成手性化合物及其手性中间体已经引起了学术界和企业界的重视,成为研究开发的热点。利用微生物酶不对称催化具有反应条件温和、转化率高及立体选择性好等优点,已经成了诸多手性合成方法的首选。本文将以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)作为β-羰基酯还原的模型底物,利用基因工程技术构建的重组大肠杆菌分别表达单一醛基还原酶和羰基还原酶,研究用这两个重组菌分别催化COBE不对称还原为相应R-或S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)的反应规律。为了解决辅酶再生的问题,构建了表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌作为还原型辅酶NADPH的再生系统,研究了分别与上述两个重组菌耦合催化4-氯乙酰乙酸乙酯还原反应的特性。 研究工作的主要进展包括: 一、从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor ZJU 010)细胞中克隆得到了醛基还原酶(NADPH-dependent aldehyde reductase,ALR)基因,构建了含ALR基因的表达质粒并转化到大肠杆菌中。通过筛选,获得高效表达醛基还原酶的重组菌E.coli M15(pQE30-ALR),经培养和诱导条件优化,该重组菌的比酶活提高到7.28 U/mg,比酶活比原始菌株高14倍。在水相反应体系中,选用COBE作为模型底物,重组菌E.coli M15(pQE30-ALR)能够催化COBE不对称还原为纯手性的R-CHBE,e.e.值高达100%,产率为98.5%;而利用赭色掷孢酵母催化的产物产率和e.e.值分别只有64.5%和63.5%。成功地解决了用酵母细胞催化COBE还原时产物e.e.较低的问题。考察了辅酶及共底物、底物和产物浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对反应的影响。结果表明,由重组菌催化的不对称还原必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及辅底物葡萄糖的参与下才能进行;底物和高浓度的产物对还原反应有抑制作用;当pH>6.0时,反应的转化率及产率都会显著降低;高密度重组细胞可以减少底物的抑制作用;通过分批加入底物的方式可以有效缓解水相体系底物的抑制,产物浓度可达90mmol/L。 二、为了解决重组菌M15(pQE30-ALR)催化还原反应中还原型辅酶NADPH不足的问题,分别从巨大芽孢杆菌B.megaterium AS1.223和B.megaterium AS1.151中克隆到了两个葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,GDH)基因gdh151和gdh223,并构建了重组菌E.coli M15(pQE30-gdh223)和M15(pQE30-gdh151)。对这两个重组菌进行诱导表达,结果发现前者的GDH比酶活是后者的11倍。对两个葡萄糖脱氢酶氨基酸序列分析结果发现,GDH223与GDH151仅有一个
论文目录:
摘要
Abstract
前言
第一章 绪论
1．1 手性化合物的重要性和研究现状
1．1．1 手性化合物的重要性
1．1．2 手性技术的研究现状
1．2 制备手性化合物的主要方法
1．2．1 手性拆分
1．2．2 化学合成
1．2．3 生物催化
1．3 微生物催化手性合成的特点和优势
1．4 生物催化β-羰基酯不对称还原反应研究进展
1．4．1 微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称合成的原理
1．4．2 催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的微生物
1．4．3 酵母细胞中催化β-羰基酯不对称还原的酶
1．4．4 生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的方法
1．4．5 影响微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯的因素
1．5 不对称还原反应过程中的辅酶再生问题
1．5．1 酶偶联法再生
1．5．2 电化学法
1．5．3 光化学法
1．5．4 利用微生物细胞辅酶再生
1．6 微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯还原反应的酶动力学
1．7 本课题拟研究的内容
参考文献
第二章 材料与方法
2．1 试验材料
2．1．1 质粒
2．1．2 菌株
2．1．3工具酶与试剂
2．1．4 培养基
2．1．5 主要仪器
2．2 试验与分析方法
2．2．1 分子克隆试验
2．2．2 菌体浓度测定
2．2．3 重组菌细胞超声破碎及胞内酶蛋白提取
2．2．4 蛋白浓度测定
2．2．5 SDS-PAGE电泳
2．2．6 重组菌表达酶的比活性(specific activity)测定
2．2．7 气／液相色谱测定底物和产物及e．e．值计算
2．2．8 数据处理方法
参考文献
第三章 醛基还原酶基因克隆、表达载体的构建及表达条件优化
3．1 引言
3．2 材料和方法
3．2．1质粒
3．2．2 菌株和培养基
3．2．3 酶和试剂盒
3．2．4 质粒提取和转化
3．2．5 醛基还原酶(aldehyde reductase，ALR)基因的克隆与重组质粒的构建
3．2．6 不同表达菌株的构建
3．2．7 菌体培养及酶蛋白表达
3．2．8 重组表达菌醛基还原酶活的测定
3．2．9 重组菌株不对称还原反应体系
3．2．10 细胞活性的检测
3．2．11 产物气／液相检测及e．e．值
3．3 结果与讨论
3．3．1 不同转化子表达醛基还原酶活性测定
3．3．2 重组菌株M15(pQE30-ALR)与原始酵母菌株酶活性比较及酶蛋白表达
3．3．3 重组菌株M15(pQE30-ALR)培养条件和诱导条件的优化
3．4 小结
参考文献
第四章 重组大肠杆菌表达醛基还原酶不对称还原生产R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究
4．1 引言
4．2 材料与方法
4．2．1 试验材料
4．2．2 试验方法
4．3 结果与讨论
4．3．1 重组菌表达醛基还原酶不对称还原COBE的反应特性
4．3．2 辅酶再生对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响
4．3．3 底物浓度对重组细胞不对称还原反应的影响
4．3．4 产物浓度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响
4．3．5 pH值对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响
4．3．6 反应温度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响
4．3．7 细胞密度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响
4．3．8 分批加入底物提高重组菌不对称还原反应的产率
4．4 小结
参考文献
第五章 重组菌高效表达葡萄糖脱氢酶及在还原型辅酶NADPH再生中的应用
5．1 引言
5．2 材料与方法
5．2．1 试验试剂
5．2．2 质粒与菌株
5．2．3 培养基与培养条件
5．2．4 葡萄糖脱氢酶基因的克隆
5．2．5 葡萄糖脱氢酶表达载体的构建
5．2．6 葡萄糖脱氢酶酶活力的测定
5．2．7 还原型辅酶NADPH浓度的测定
5．2．8 产物气相和液相色谱测定
5．3 结果与讨论
5．3．1 重组菌表达葡萄糖脱氢酶的性质
5．3．2 克隆和重组表达的葡萄糖脱氢酶基因的测序及同源性分析
5．3．3 重组菌表达葡萄糖脱氢酶酶比活性的测定
5．3．4 重组菌M15(pQE30-gdh223)表达葡萄糖脱氢酶条件优化
5．3．5 重组菌M15(pQE30-gdh223)实现辅酶的产生与再生
5．3．6 重组菌M15(pQE30-gdh223)在生物催化不对称反应中的应用
5．4 小结
参考文献
第六章 重组菌E．coli M15(pQE30-gdh223)与E．coli M15(pQE30-ALR)耦合催化COBE不对称还原的研究
6．1 引言
6．2 材料和方法
6．2．1 菌种
6．2．2 培养基及培养方法
6．2．3 酶活测定和细胞活性的研究
6．2．4 不对称还原反应体系
6．2．5 气相和液相色谱检测
6．3 结果和讨论
6．3．1 两重组菌耦合实现还原型辅酶再生的反应机理
6．3．2 底物浓度和两种重组菌质量比对双菌耦合转化反应的影响
6．3．3 反应温度对双菌耦合转化反应的影响
6．3．4 葡萄糖浓度对双菌耦合转化反应的影响
6．3．5 转速对双菌耦合转化反应的影响
6．3．6 底物分批加入对提高双菌耦合转化率的影响
6．3．7 两相体系双菌耦合转化COBE的研究
6．4 小结
参考文献
第七章 葡萄糖脱氢酶和醛基还原酶协同催化COBE不对称还原反应的酶动力学研究
7．1 引言
7．2 材料与方法
7．2．1 试验试剂
7．2．2 初酶提取与纯化
7．2．3 酶蛋白浓度测定
7．2．4 反应初速度测定
7．2．5 产物气相和液相色谱检测
7．2．6 数学模型的建立
7．3 结果与讨论
7．3．1 传质对酶的影响
7．3．2 醛基还原酶催化COBE还原反应的动力学常数的确定
7．3．3 葡萄糖脱氢酶催化COBE还原反应的动力学常数的确定
7．4 双酶耦合辅酶循环再生催化COBE还原反应动力学
7．4．1 双酶体系反应初速度的求解
7．4．2 双酶的酶活性比对双酶体系转化效率的影响
7．4．3 总辅酶浓度对双酶体系转化效率的影响
7．4．4 对双酶体系辅酶随时间变化曲线的模拟
7．5 小结
参考文献
第八章 双菌耦合体系催化COBE不对称还原生产S-CHBE的研究
8．1 引言
8．2 材料和方法
8．2．1 质粒、菌种和菌体培养
8．2．2 工具酶和试剂盒
8．2．3 羰基还原酶基因的克隆
8．2．4 羰基还原酶表达载体的构建
8．2．5 羰基还原酶酶活测定
8．2．6 转化反应体系
8．2．7 产物气相和液相检测
8．3 结果与讨论
8．3．1 培养基的优化
8．3．2 诱导时间和诱导剂量的优化
8．3．3 表达时间的确定
8．3．4 重组菌与原始菌株比酶活的比较
8．3．5 重组菌表达羰基还原酶不对称还原COBE的反应产物检测
8．3．6 辅酶再生对重组菌E．coliM15(pQE30-CAR)不对称还原COBE的影响
8．3．7 底物浓度对单菌转化及双菌耦合转化体系产率的影响
8．3．8 E．coli M15(pQE30-CAR)及E．coli M15(pQE30-gdh223)质量比对产物得率的影响
8．3．9 温度对双菌耦合转化反应的产率的影响
8．3．10 两相体系分批补加菌体对双菌耦合转化反应产率的影响
8．4 小结
参考文献
结论
本论文符号表
攻读博士学位期间发表的论文
致谢
发布时间: 2006-05-10
参考文献
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