卡介菌多糖核酸体外抗病毒活性试验研究

论文摘要

卡介菌多糖核酸（Polysaccharide nucleic acid fraction of Bacillus Calmette Guerin,BCG-PSN）是一种具有免疫调节作用的生物活性物质。研究表明,BCG-PSN具有多种生物学功能,可提高细胞和体液免疫,刺激T细胞增殖以及增强巨噬细胞的各种功能等。目前,BCG-PSN的应用报道多集中在人类医学上,主要用于预防和治疗哮喘、慢性支气管炎、结核、过敏性鼻炎、皮肤过敏性疾病、白癫风、肿瘤等多种疾病。然而,BCG-PSN在兽医临床中的应用鲜有报道,更缺乏深入研究。另外,卡介菌多糖核酸是由多糖组份与核酸组份共同构成,其两种组份的确切成份、具体功能以及哪种组份起主要作用均不明确。本文在原有工艺基础上改进了细菌破壁的方法,采用低温超声波破壁技术及热酚法提取BCG-PSN,并利用DEAE-纤维素阴离子柱交换层析分离多糖和核酸,为深入研究其结构与功能奠定基础。同时,本文通过BCG-PSN对感染水疱口炎病毒（VSV）鸡胚成纤维细胞的病毒抑制试验,初步探讨BCG-PSN对VSV的体外抗病毒效果及机制,为以后的深入研究及其兽医临床应用提供理论和实验基础。卡介菌多糖核酸的提取与分离：采用超声波在低温环境下破碎BCG的细胞壁,利用热酚法去除菌体蛋白获得BCG-PSN,用硫酸苯酚法检测糖含量,紫外分光光度计测定其核酸含量。结果显示,从BCG中提取BCG-PSN的提取率为1.06%。所得的BCG-PSN中多糖的含量占72.6%,核酸占23.5%。取1g的BCG-PSN经DEAE-纤维素阴离子柱交换层析分离,得到0.615g白色易溶于水的多糖及0.16g淡黄色不易溶于水的核酸,经鉴定多糖与核酸均得到较好的分离。体外抗病毒试验：为探讨卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）的抗病毒效果,将BCG-PSN作用于离体培养的鸡胚成纤维（CEF）细胞,用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测BCG-PSN对CEF细胞活性的影响；用细胞病变法（CPE）检测BCG-PSN对水疱口炎病毒（VSV）的抑制作用,并在安全浓度范围内筛选BCG-PSN抑制VSV的最佳作用时间和最佳作用剂量。试验结果表明,当BCG-PSN质量浓度大于800μg/mL时对CEF细胞均具有明显的毒性作用：BCG-PSN能显著抑制VSV在CEF细胞上的生长,但BCG-PSN对VSV的抑制作用并非随着其剂量的增加和作用时间的延长而增强,144.0μg/mL的BCG-PSN在CEF细胞上作用24h后,产生的抗病毒活性最强。BCG-PSN可诱导CEF细胞产生IFN-α和IFN-β,当药物浓度为144.0μg/mL时IFN-α的含量达到最大值,虽然此时IFN-β的升高变化并不明显,但当药物BCG-PSN的质量浓度升高到287.5μg/mL时,IFN-β的含量也渐趋达到最大值。上述结果表明,BCG-PSN的抗病毒作用与其诱导的干扰素有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及縮略语说明
• 文献综述
• 1 BCG-PSN的结构特点
• 2 BCG-PSN提取工艺研究
• 2.1 多糖的提取及纯化
• 2.2 核酸的提取及纯化
• 3 BCG-PSN的药理学作用及特点
• 3.1 调节Th1/Th2平衡
• 3.2 调节Tc1/Tc2平衡
• 3.3 诱导产生干扰素
• 3.4 激活Toll信号转导通路
• 3.5 调节体液免疫
• 3.6 非特异性免疫作用
• 4 BCG-PSN的毒理作用及特点
• 5 BCG-PSN在临床上的应用
• 参考文献
• 试验部分
• 第一章 BCG-PSN及其组份的提取与分离
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 BCG-PSN的提取与鉴定
• 2.2 多糖和核酸组份的分离与测定
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 BCG-PSN体外抗病毒活性试验
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 BCG-PSN对CEF细胞活性的影响
• 2.2 VSV TCID50的检测结果
• 2.3 BCG-PSN抑制VSV在CEF细胞上生长的效果
• 2.4 BCG-PSN最佳作用剂量筛选
• 2.5 BCG-PSN的最佳作用时间的筛选
• 2.6 BCG-PSN诱导CEF细胞产生IFN-α和IFN-β
• 2.7 实时荧光定量PCR测定CEF中Ⅰ型IFN mRNA表达
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 发表论文