猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立及NS、NP蛋白细胞定位研究

论文摘要

猪流感（swine influenza, SI）,是由猪流感病毒（swine influenza virus, SIV）引起的一种急性传染性呼吸道疾病,该病会对养猪业造成重大的经济损失并危害人畜健康。NS1是病毒的重要调节蛋白,与病毒毒力有关,并和细胞内的多种蛋白相互作用,发挥多种不同的生物学功能,NS1可用来区分自然感染猪群与灭活疫苗免疫猪群。NP基因高度保守,其编码核衣壳蛋白,是病毒分型的主要依据。本研究对猪流感病毒H1N2亚型A/swine/Shanghai/1/2007分离株的NS1、NP基因进行PCR扩增,并克隆到pET-32a（+）和pET-30a（+）表达载体,经PCR鉴定和酶切鉴定获得阳性克隆,对插入的DNA片段进行测序并证实其阅读框架正确。构建的重组质粒pET-32a（+）-NS1、pET-30a（+）-NP分别转化BL21（DE3）和BL21（DE3）pLysS感受态,经终浓度1mmol/L的IPTG诱导,结果表明NS1和NP基因在大肠杆菌中成功表达。重组蛋白NS1、NP分子量分别为43.9kD和63.4kD。重组蛋白NS1和NP经Ni2+亲和层析柱纯化后用BCA蛋白定量试剂盒分析,NS1、NP蛋白浓度分别为324.33μg/mL和320μg/mL。将纯化的蛋白腹腔免疫Balb/c小鼠,制备抗NS1和抗NP的多克隆抗体,并用间接ELISA方法检测其抗体效价。利用纯化的重组蛋白NS1作为诊断抗原建立了针对SIV抗体的间接ELISA检测方法,并确定了最优的工作条件。抗原最适包被浓度0.2μg/mL,鼠阳性血清最佳稀释度1:10000,猪阳性血清最佳稀释度为1:10,血清作用时间37℃60min,加入BL21（DE3）空诱导菌破碎液的终浓度为1%,酶标二抗稀释度1:10000,酶标二抗作用时间37℃60min,判定阴阳性的临界值为0.286。特异性试验表明该NS1间接ELISA检测方法特异性较好,并且该方法能应用于自然感染和灭活疫苗免疫的鉴别诊断。通过构建真核表达质粒pEGFP-N1-NS1、pEGFP-N1-NS、pEGFP-N1-NP转染MDCK细胞,表达带有绿色荧光蛋白标记的NS1、NS、NP蛋白,DAPI染色后荧光显微镜观察其细胞定位。构建真核表达质粒pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS、pCAGGS-NP,并将其转染MDCK细胞表达NS1、NS、NP蛋白,利用抗NS1和抗NP多克隆抗体,进行间接免疫荧光试验,荧光显微镜观察表达的蛋白并确定其细胞定位。结果均表明NS1蛋白、NS蛋白（包括NS1和NS2）以及NP蛋白主要定位于细胞核,为进一步研究’NSl、NP蛋白在病毒复制过程中的生物学功能和猪流感病毒的复制机理奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 猪流感病毒的研究进展
• 1 猪流感病毒结构及生物学特性
• 2 猪流感病毒编码蛋白及功能
• 2.1 凝素蛋白（Hemagglutinin,HA）
• 2.2 神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）
• 2.3 聚合酶蛋白（Polymerase）
• 2.4 基质蛋白（Matrix,M）
• 2.5 核蛋白（Nucleoprotein,NP）
• 2.6 NS蛋白（Nonstructural protein,NS）
• 3 猪流感病毒的复制过程
• 4 猪流感病毒的流行病学
• 5 猪流感病毒的种间传播和遗传变异
• 5.1 猪流感病毒的种间传播
• 5.2 猪流感病毒的遗传变异
• 6 猪流感病毒的诊断技术
• 6.1 猪流感病毒分离
• 6.2 清学检测方法
• 6.2.1 琼脂扩散（AGID）试验
• 6.2.2 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验
• 6.2.3 神经氨酸酶抑制试验（NI）
• 6.2.4 中和试验（NT）
• 6.2.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 6.2.6 免疫过氧化酶单层细胞试验
• 6.2.7 荧光抗体试验（immunofluorescence assay,IFA）
• 6.2.8 免疫组织化学试验
• 6.3 猪流感病毒分子生物学检测
• 6.3.1 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）
• 6.3.2 实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR）
• 6.3.3 NASBA法
• 6.4 其它诊断方法
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第二章 猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007株NS1、NP基因的原核表达及多克隆抗体的制备
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种、质粒、病毒及实验动物
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 原核表达质粒pET-32a（+）-NS 1和pET-30a（+）-NP的构建
• 1.2.1.1 引物设计与合成
• 1.2.1.2 目的基因的PCR扩增与回收
• 1.2.1.3 目的片段与载体的连接与转化
• 1.2.1.4 阳性重组质粒的筛选
• 1.2.2 重组质粒pET-32a（+）-NS1和pET-30a（+）-NP的原核表达及NS1、NP蛋白的纯化
• 1.2.2.1 重组表达质粒的原核表达
• 1.2.2.2 表达产物NS1、NP蛋白的SDS-PAGE分析
• 1.2.2.3 Western blot检测重组蛋NS1、NP的表达
• 1.2.2.4 重组蛋NS1、NP的大量表达、变性
• 1.2.2.5 重组蛋白NS1、NP的纯化
• 1.2.2.6 重组蛋白的复性
• 1.2.2.7 重组蛋白浓度测定
• 1.2.3 抗NS1蛋白及抗NP蛋白多克隆抗体的制备
• 1.2.4 NS1、NP蛋白间接ELISA检测
• 2 结果
• 2.1 重组表达质粒pET-32a（+）-NS1和pET-30a（+）-NP的构建
• 2.2 重组质粒pET-32a（+）-NS1、pET-30a（+）-NP分别在大肠杆菌BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS中的诱导表达
• 2.3 Western blot检测重组蛋白NS1、NP
• 2.4 NS1、NP蛋白纯化结果
• 2.5 蛋白浓度测定
• 2.6 NS1、NP蛋白间接ELISA检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 抗原
• 1.1.2 血清和酶标抗体
• 1.2 方法
• 1.2.1 重组蛋白抗原最适包被浓度和标准血清最佳稀释度的确定
• 1.2.2 确定间接ELISA检测中的各种工作条件
• 1.2.2.1 标准血清作用时间的确定
• 1.2.2.2 BL21（DE3）空诱导菌破碎液终浓度的确定
• 1.2.2.3 酶标二抗作用稀释度的确定
• 1.2.2.4 酶标二抗作用时间的确定
• 1.2.3 NS1间接ELISA方法对临床样品的检测及临界值的确定
• 1.2.4 NS1间接ELISA的特异性试验
• 2 结果
• 2.1 重组蛋白抗原最适包被浓度和标准血清最佳稀释度的确定
• 2.2 标准血清作用时间的确定
• 2.3 BL21（DE3）空诱导菌破碎液终浓度的确定
• 2.4 酶标二抗作用稀释度的确定
• 2.5 酶标二抗作用时间的确定
• 2.6 NS1间接ELISA方法对临床样品的检测及临界值的确定
• 2.7 NS1间接ELISA的特异性试验
• 2.7.1 与H3型SIV的单抗的ELISA检测
• 2.7.2 与H1N2亚型SIV阳性血清的ELISA检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007株NS1、NS、NP基因的真核表达及核定位研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种、质粒、病毒及细胞
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 真核表达载体pEGFP-N1-NS1、pEGFP-N1-NS、pEGFP-N1-NP的构建
• 1.2.1.1 引物设计与合成
• 1.2.1.2 目的片段PCR扩增与回收,连接载体并转化,筛选阳性重组质粒
• 1.2.2 真核表达载体pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS、pCAGGS-NP的构建
• 1.2.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2.2 目的片段PCR扩增与回收,连接载体并转化,筛选阳性重组质粒
• 1.2.3 真核表达载体的表达和NS1、NS、NP蛋白的细胞定位分析
• 2 结果
• 2.1 真核表达载体pEGFP-N1-NS1、pEGFP-N1-NS、pEGFP-N1-NP的构建
• 2.2 真核表达载体pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS、pCAGGS-NP的构建
• 2.3 NS1、NS、NP蛋白在真核细胞中的表达及细胞定位分析
• 2.3.1 真核表达载体pEGFP-N1-NS1、pEGFP-N1-NS、pEGFP-N1-NP表达产物的细胞定位分析
• 2.3.2 真核表达载体pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS、pCAGGS-NP表达产物的细胞定位分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢