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酪蛋白活性肽对乳酸菌生长代谢及酸乳发酵影响的研究

2020-12-11阅读(648)

酪蛋白活性肽对乳酸菌生长代谢及酸乳发酵影响的研究

论文摘要

由于乳酸菌缺乏某些生物合成途径,不能合成其生长所必需的一些维生素和氨基酸等物质,对营养要求苛刻。另一方面由于乳酸菌对蛋白的水解能力有限,牛乳中游离氨基酸及寡肽含量很低,导致乳酸菌在牛乳中生长缓慢,造成酸乳发酵时间较长。嗜热链球菌（球菌）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（杆菌）是酸乳最常用的发酵剂菌株。本文以酪蛋白为原料,通过五种的蛋白酶（碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶）进行酶解并对其酶解特性进行了研究,利用促进乳酸菌（球菌和杆菌1:1）生长活性实验评价了五种酪蛋白水解物的生物活性。从乳酸菌生长代谢机制出发,考察了不同酪蛋白酶解物对乳酸菌生长状态、产乳酸、生物合成胞外多糖（EPS）及乳酸菌发酵酸乳的影响。进一步研究了酪蛋白酶解物在乳酸菌发酵过程中对涉及乳酸菌乳酸生物合成途径,即糖酵解途径和EPS生物合成途径中关键酶活性的影响。最后,利用膜分离、大孔吸附树脂色谱、凝胶渗透色谱和高效液相色谱（HPLC）一系列分离技术从活性最强的酪蛋白酶解物中分离纯化得到了具有促乳酸菌生长活性的酪蛋白肽,并利用液相色谱质谱联用（HPLC-MS/MS）技术结合氨基酸分析对纯化后的肽进行了一级序列结构鉴定。分别采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶对酪蛋白进行酶解,以促进乳酸菌生长活性为指标,筛选出各种蛋白酶的最佳水解条件,得到促生长活性最好的酪蛋白水解物。进一步将酪蛋白酶解物进行膜分离,得到分子量段不同的酪蛋白水解物,并评价了不同分子量段的酪蛋白水解物促乳酸菌的增殖活性。研究了不同蛋白酶、水解度、分子量和氨基酸组成对水解物的促乳酸菌增殖作用的影响。结果表明,酪蛋白水解物的水解度与促生长活性没有明显的相关性;酪蛋白分别用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶进行水解12 h（CHA、CHF、CHN和CHT）以及用木瓜蛋白酶水解8 h （CHP）得到促生长活性较强的水解物;分子量（Mw）小于3 kDa段的各种酪蛋白活性肽（CHA-Ⅳ、CHF-Ⅳ、CHN-Ⅳ、CHP-Ⅳ和CHT-Ⅳ）具有比其它分子量段更好的促生长活性;酪蛋白水解物中富含的亲水性氨基酸（组氨酸、赖氨酸、谷氨酸和丝氨酸）对乳酸菌的生长具有更好促生长作用,而含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸）对水解物的促生长活性没有明显的影响。研究了五种Mw < 3 kDa段酪蛋白水解物（CHA-Ⅳ、CHF-Ⅳ、CHN-Ⅳ、CHP-Ⅳ和CHT-Ⅳ）对乳酸菌在72 h发酵过程中乳酸菌活菌数、乳酸生成、葡萄糖消耗以及糖酵解关键酶（葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶）活性的影响。结果表明,五种酪蛋白活性肽段（Mw < 3 kDa）的添加均能够提高球菌的活菌数,尤其是在对数生长期的影响更显著,而对此阶段杆菌活菌数没有太大的影响;酪蛋白活性肽能够减缓乳酸菌活菌数在生长后期的下降趋势;对乳酸菌发酵液菌体量都有不同程度的提高作用,其中CHP-Ⅳ的影响最显著;与此同时,由于各种酪蛋白肽段的添加发酵液pH下降趋势均有不同程度的加剧,加速了发酵过程葡萄糖的消耗速度,其中以CHP-Ⅳ的影响最明显;酪蛋白活性肽段的添加明显提高了丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶这两种酶活性,但是对葡萄糖激酶和乳酸脱氢酶的酶活性影响不大,并且,丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的酶活性与乳酸菌产乳酸量有很好的相关性。考察了CHA-Ⅳ、CHF-Ⅳ、CHN-Ⅳ、CHP-Ⅳ和CHT-Ⅳ对乳酸菌72 h发酵过程中胞外多糖（EPS）产量、单糖组分和EPS合成途径中关键酶（α-磷酸葡糖糖变位酶、β-磷酸葡糖糖变位酶、TDP-葡糖糖焦磷酸化酶、UDP-葡糖糖焦磷酸化酶和UDP-半乳糖-4-异构酶）活性的影响。结果表明,五种酪蛋白活性肽段（Mw < 3 kDa）的添加都能提高乳酸菌EPS产量,但对EPS产量的影响不同;乳酸菌EPS主要是由葡萄糖、半乳糖和鼠李糖组成,其单糖组成比例随着发酵时间的变化而有所不同,各种酪蛋白活性肽段（Mw < 3 kDa）的添加对EPS单糖组成比例没有影响;α-磷酸葡萄糖变位酶、TDP-葡萄糖焦磷酸化酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶影响乳酸菌EPS发酵过程中的产量。UDP-半乳糖-4-异构酶和β-磷酸酪蛋白活性肽段（Mw < 3 kDa）变位酶对EPS产量没有影响。Mw < 3 kDa段酪蛋白活性肽的添加能够提高α-磷酸葡糖糖变位酶、TDP-葡糖糖焦磷酸化酶、UDP-葡糖糖焦磷酸化酶和UDP-半乳糖-4-异构酶这四种酶活性,而对β-磷酸葡糖糖变位酶活性没有影响。研究了Mw < 3 kDa段木瓜蛋白酶水解酪蛋白活性肽（CHP-Ⅳ）对酸乳发酵过程的影响（发酵过程中pH值,凝乳时间,产酸量和产酸速度以及发酵时间等发酵参数）以及对发酵乳储藏期品质的影响,包括对发酵乳质构特性、稳定性、后酸化和乳酸菌活性变化的影响。结果表明,在一定添加量范围内（1.5-3.0%等量蛋白替代, w/w）,CHP-Ⅳ对酸乳促发酵能力随着添加量的增加而增强。在3.0%（w/w）的等量蛋白替代下,酸乳发酵时间缩短了21.9%;超过了3.0%（w/w）的添加量,即在6.0%（w/w）的添加量下,该水解物的促发酵效果不明显;在3.0%（w/w）的添加量下能够明显延缓酸乳在储藏期的后酸化;能够明显提高酸乳储藏期间球菌的活性,但是对杆菌的活性有轻微的抑制作用;该水解物不仅能够明显提高酸乳储藏期间的活菌总数而且还改变了球/杆菌数比例;对储藏期酸乳的硬度没有明显的改变,但是可以提高酸乳的粘度,明显提高酸乳的感官质量。通过大孔吸附树脂色谱、凝胶渗透色谱和反相高效液相色谱等系列分离技术,分别根据酪蛋白肽的亲疏水性、分子量大小和极性大小等性质的不同对Mw < 3 kDa段的酪蛋白木瓜蛋白酶水解物（CHP-Ⅳ）进行逐级分离纯化,同时评价了各级分离产物的促乳酸菌生长活性,以HPLC-MS/MS结合氨基酸分析对纯化得到的功能肽的氨基酸序列结构进行鉴定,首次分离得到三个具有显著促乳酸菌生长活性的酪蛋白肽CHP-Ⅳ-F1-G1-H2 （Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Asn-Leu）、CHP-Ⅳ-F2-P2-Hb （Asp-Ile-Pro-Asn- Pro-Ile）和CHP-Ⅳ-F2-P2-Hc （Pro-Ile-Val-Leu-Asn-Pro）。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 乳酸菌简介
  • 1.2 乳酸菌的生理功能
  • 1.3 乳酸菌发酵剂的组成
  • 1.4 乳酸菌发酵剂的作用
  • 1.4.1 发酵乳酸菌种的特点
  • 1.4.2 发酵产生乳酸
  • 1.4.3 产生风味物质
  • 1.4.4 生物合成胞外多糖
  • 1.4.5 分解蛋白质
  • 1.5 乳酸菌促生长因子的研究进展
  • 1.5.1 乳酸菌营养要求
  • 1.5.2 乳酸菌促生长因子的研究进展
  • 1.6 酪蛋白活性肽的研究进展
  • 1.6.1 酪蛋白肽的生理活性
  • 1.6.2 生物活性肽制备技术研究进展
  • 1.6.3 生物活性肽分离纯化技术研究进展
  • 1.6.4 生物活性肽结构鉴定技术研究进展
  • 1.7 本课题研究的立题依据和主要研究内容
  • 1.7.1 立题依据
  • 1.7.2 主要研究内容
  • 参考文献
  • 第二章 酪蛋白水解物对乳酸菌促生长作用的研究
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与仪器设备
  • 2.2.1 主要原料与试剂
  • 2.2.2 菌种
  • 2.2.3 培养基
  • 2.2.4 培养条件
  • 2.2.5 主要仪器设备
  • 2.3 实验分析方法
  • 2.3.1 生长曲线的绘制
  • 2.3.2 酪蛋白水解物的制备
  • 2.3.3 水解物水解度（DH）的测定
  • 2.3.4 水解物蛋白含量的测定
  • 2.3.5 水解物分子量分布的测定
  • 2.3.6 促进乳酸菌生长活性的测定
  • 2.3.7 pH值的测定
  • 622值的测定'>2.3.8 OD622值的测定
  • 2.3.9 膜超滤分离酪蛋白水解物
  • 2.3.10 酪蛋白水解液的氨基酸组成分析
  • 2.4 结果与讨论
  • 2.4.1 乳酸菌的生长曲线
  • 2.4.2 同种蛋白酶不同水解程度酪蛋白水解物对乳酸菌的促生长作用
  • 2.5 本章小结
  • 参考文献
  • 第三章 酪蛋白活性肽对乳酸菌产乳酸影响的研究
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与仪器设备
  • 3.2.1 主要材料与试剂
  • 3.2.2 主要仪器设备
  • 3.3 实验分析方法
  • 3.3.1 乳酸菌活菌数的测定
  • 3.3.2 pH值的测定
  • 622值的测定'>3.3.3 OD622值的测定
  • 3.3.4 葡萄糖消耗的测定
  • 3.3.5 乳酸浓度的测定
  • 3.3.6 发酵液的处理及粗酶液制备
  • 3.3.7 酶活性检测
  • 3.3.8 蛋白质含量测定
  • 3.4 结果与讨论
  • w< 3kDa）对乳酸菌发酵液pH和OD值的影响'>3.4.1 酪蛋白活性肽段（Mw< 3kDa）对乳酸菌发酵液pH和OD值的影响
  • w< 3kDa）对乳酸菌活菌数的影响'>3.4.2 酪蛋白活性肽段（Mw< 3kDa）对乳酸菌活菌数的影响
  • w< 3kDa）对乳酸菌消耗葡萄糖的影响'>3.4.3 酪蛋白活性肽段（Mw< 3kDa）对乳酸菌消耗葡萄糖的影响
  • w< 3kDa）对乳酸菌产乳酸的影响'>3.4.4 酪蛋白活性肽段（Mw< 3kDa）对乳酸菌产乳酸的影响
  • w< 3kDa）对酶活性的影响'>3.4.5 酪蛋白活性肽段（Mw< 3kDa）对酶活性的影响
  • 3.5 本章小结
  • 参考文献
  • 第四章 酪蛋白活性肽对乳酸菌胞外多糖生物合成的影响
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与仪器设备
  • 4.2.1 主要材料与试剂
  • 4.2.2 主要仪器设备
  • 4.3 实验分析方法
  • 4.3.1 胞外多糖的分离纯化
  • 4.3.2 胞外多糖含量的测定
  • 4.3.3 胞外多糖单糖组成成分分析
  • 4.3.4 发酵液的处理及粗酶液制备
  • 4.3.5 酶活性检测
  • 4.3.6 蛋白质含量测定
  • 4.4 结果与讨论
  • w< 3kDa）对乳酸菌EPS生物合成的影响'>4.4.1 酪蛋白活性肽段（Mw< 3kDa）对乳酸菌EPS生物合成的影响
  • 4.4.2 EPS中单糖组成成分分析
  • w<3 kDa）对涉及乳酸菌EPS生物合成途径关键酶 酶活性的影响'>4.4.3 酪蛋白活性肽段（Mw<3 kDa）对涉及乳酸菌EPS生物合成途径关键酶 酶活性的影响
  • 4.5 本章小结
  • 参考文献
  • 第五章 酪蛋白活性肽对酸乳发酵过程和酸乳质量的影响
  • 5.1 引言
  • 5.2 材料与仪器设备
  • 5.2.1 主要材料与试剂
  • 5.2.2 主要仪器设备
  • 5.3 实验分析方法
  • 5.3.1 酸乳的制备
  • 5.3.2 酸乳酸度的测定
  • 5.3.3 酸乳产酸速度的测定
  • 5.3.4 酸乳乳酸菌活菌数的测定
  • 5.3.5 酸乳质构的测定
  • 5.3.6 酸乳的感官评定
  • 5.4 结果与讨论
  • w< 3kDa段木瓜蛋白酶酪蛋白活性肽对酸乳发酵过程的影响'>5.4.1 Mw< 3kDa段木瓜蛋白酶酪蛋白活性肽对酸乳发酵过程的影响
  • w< 3kDa段木瓜蛋白酶酪蛋白活性肽对酸乳储存期品质的影响'>5.4.2 Mw< 3kDa段木瓜蛋白酶酪蛋白活性肽对酸乳储存期品质的影响
  • 5.5 本章小结
  • 参考文献
  • 第六章 酪蛋白活性肽的分离纯化与鉴定
  • 6.1 引言
  • 6.2 材料与仪器设备
  • 6.2.1 材料
  • 6.2.2 主要试剂
  • 6.2.3 主要仪器设备
  • 6.3 实验分析方法
  • 6.3.1 大孔树脂分离
  • 6.3.2 凝胶渗透色谱（GPC）分离
  • 6.3.3 高效液相色谱（HPLC）分离
  • 6.3.4 HPLC-ESI-MS/MS 鉴定酪蛋白活性肽
  • 6.3.5 酪蛋白肽的氨基酸组成成分分析
  • 6.3.6 促乳酸菌生长活性测试
  • 6.3.7 酪蛋白活性肽和游离氨基酸混合物对乳酸菌活菌数的影响
  • 6.4 结果与讨论
  • 6.4.1 大孔树脂分离纯化CHP-IV组分
  • 6.4.2 GPC分离纯化CHP-IV-F1 和CHP-IV-F2 组分
  • 6.4.3 HPLC分离纯化CHP-IV-F1-G1 和CHP-IV-F2-P2 组分
  • 6.4.4 酪 蛋 白 活 性 肽 CHP-IV-F1-G1-H2 、 CHP-IV-F2-P2-Hb 和 CHP-IV-F2-P2-Hc 的氨基酸组成及序列鉴定
  • 6.4.5 酪蛋白活性肽对乳酸菌活菌数的影响
  • 6.5 本章小结
  • 参考文献
  • 结论与展望
  • 一、结论
  • 二、本论文的主要创新点
  • 三、展望
  • 攻读博士学位期间取得的研究成果
  • 致谢
  • 答辩委员会对论文的评定意见

    • 相关论文文献

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