基于食品蛋白和天然多糖的生物大分子自组装

论文题目: 基于食品蛋白和天然多糖的生物大分子自组装

论文类型: 博士论文

论文专业: 高分子化学与物理

作者: 喻绍勇

导师: 江明,姚萍

关键词: 自组装,纳米凝胶,白蛋白,溶菌酶,酪蛋白,壳聚糖,药物输送

文献来源: 复旦大学

发表年度: 2005

论文摘要: 自组装是指分子或者分子的一部分自发地形成有序结构的过程。经过多年的发展，自组装已经在众多的合成高分子体系中取得成功。现在有越来越多的研究开始利用生物高分子在体外进行组装。生物高分子可以利用特有的相互作用如蛋白质的特异性相互作用、DNA的碱基互补等进行组装。在众多的生物高分子组装体系中，没有特异性相互作用的球状蛋白之间的组装较少有文献涉及。虽然现在已经有利用单一的球状蛋白在特定的变性条件下通过静电相互作用和疏水相互作用得到纤维状组装体的报道，也有利用交联剂制备蛋白质微球的报道，但限于操控天然球状蛋白分子之间的非共价键相互作用的复杂性，到目前为止，还没有见到利用天然的、没有特异性相互作用的球状蛋白分子自组装制备纳米凝胶的报道。蛋白质，尤其是食品中的蛋白质，本身是一类营养物质，无毒，可以食用，具有良好的生物相容性，在消化系统内可以被降解，很适合于作为口服药物载体。因此，利用食品蛋白质进行自组装，不仅具有研究价值，而且具有应用前景。本论文的工作主要集中在利用天然高分子，包括球状和链状的食品蛋白质、天然的带电荷和不带电荷的多糖进行自组装，得到生物大分子胶束或者生物大分子微凝胶。文中首次提出了一种方便的利用一对带相反电荷的蛋白质，或者利用带相反电荷的蛋白质和多糖进行组装制备微凝胶的方法，并在多个体系中取得成功。我们所实现的上述生物大分子组装，与线性合成高分子的自组装，以及传统的利用蛋白质之间的特异性相互作用引起的组装均有很大的不同。我们所发展的利用食品蛋白质和天然多糖制备微凝胶的方法简单易行，除pH调节所需要的酸和碱以外，在制备过程中不加入其他化学物质，因而所得到的微凝胶无毒、生物相容、可生物降解、可以食用，适合于作为药物载体。具体来说，本论文包括了以下三个部分的工作：第一部分是利用两种等电点不同的食品蛋白质通过加热变性进行自组装制备纳米微凝胶。白蛋白和溶菌酶都是鸡蛋清中的蛋白质，其中，白蛋白的等电点在4.8而溶菌酶的等电点在10.7。我们发展的方法如下：在弱酸性溶液中混合这两种蛋白质，此时二者的相互作用不是很强；然后调节溶液pH到溶菌酶的等电点附近，在这过程中，二者先是形成静电络合物，接着静电络合物发生分子重排，溶菌酶分子因为其静电荷趋于零而倾向于聚集，白蛋白分子因为带有较多的负电荷而倾向于互相远离；再加热溶液，使两种蛋白质变性以形成分子间的疏水作用和二硫键，即可得到稳定的纳米粒子。文中我们对这两种蛋白质通过加热变性进行自组装的条件进行了详细的研究，找到了最佳的制备条件。并用AFM和TEM观察了所制备的纳米粒子的形貌。结合球状蛋白自身的性质和光散射研究的结果我们判断出所制备的球形纳米粒子是一种微相水凝胶，即球状蛋白的微凝胶。然后，我们又用ζ电位、离心超滤分离、聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法确定了凝胶粒子的核壳结构，其核是由变性的溶菌酶分子和一小部分变性的白蛋白分子所构成，而壳层则主要由变性的白蛋白分子构成。所形成的凝胶粒子能可逆、稳定地分散在pH小于4和大于6.3的溶液中。而在白蛋白的等电点附近，由于凝胶粒子表面所带的电荷趋于零而形成二次聚集体。为了解决此问题，我们用安全、无毒、在自然界中自然发生的Maillard反应，将葡聚糖的末端羟基与白蛋白分子表面的赖氨酸进行偶联，然后将接有葡聚糖的白蛋白与溶菌酶进行组装，得到了在白蛋白等电点也能稳定分散的纳米凝胶。根据对以上自组装形成纳米凝胶机理的理解，我们发展了一种通用的利用一对带相反电荷的蛋白质进行组装制备微凝胶的方法，并在多个体系中取得成功。第二部分是利用壳聚糖和白蛋白制备pH敏感的纳米水凝胶。在前一个体系成功的基础上，我们选择了在生物医学领域应用广泛的壳聚糖和白蛋白分子进行组装。壳聚糖是唯一一种天然的阳离子型多糖，具有抗菌、生物相容、抗肿瘤等多种作用，在酸性条件下可以质子化而溶于水。将壳聚糖和白蛋白在酸性溶液以适当的比例混合后并调节混合溶液的pH到适当值，然后加热使白蛋白变性即可得到稳定的凝胶粒子。我们对制备条件进行了较为详细地探讨，得到了优化的制备方案。SEM和TEM观察表明凝胶粒子具有一定的核壳结构。通过对凝胶粒子ζ电位的研究，并结合凝胶粒子的溶解性质，我们认为凝胶粒子的外层是由伸展的壳聚糖链所构成，而白蛋白和被冻结在白蛋白微凝胶网络中的壳聚糖链，共同构成了凝胶粒子的内核。通过动态光散射的研究，我们发现所制备的微凝胶粒径由于凝胶粒子电荷的变化而具有pH敏感性。最后，以芘作为疏水荧光探针，我们发现所制备的凝胶粒子在不同的pH环境下具有不同的亲／疏水性。第三部分是利用葡聚糖接枝的β-酪蛋白实现了对活性物质溶菌酶分子的包埋和释放，发现释放出的溶菌酶分子完全保留了其生物活性。β-酪蛋白是牛奶蛋白中的一种组分，是一种线性的蛋白质分子，等电点是pH4.8。通过Maillard反应将分子量35kDa的葡聚糖分子接枝到β-酪蛋白上制备了全水溶性的接枝聚合物。当把溶菌酶的水溶液滴加到上述接枝共聚物的水溶液中，并调节溶液的pH至某一合适值，即可得到以β-酪蛋白和溶菌酶的静电络合物为核、酪蛋白上接枝的葡聚糖为壳的胶束。在一定的酸、碱或盐的条件下，溶菌酶还可以从胶束中释放出来。对微球菌裂解的实验表明释放出的溶菌酶分子具有和单独的溶菌酶分子相同的活性。我们还研究了加入Ca2+离子对胶束稳定性的作用。当使用疏水性更强、含有更多磷酸基团的酪蛋白代替β-酪蛋白时，发现所制备的胶束在酸、碱、盐条件下的稳定性有所增加。

论文目录:

中文摘要

Abstract

第一章引言

1.1 纳米科技简介

1.2 大分子自组装简述

1.2.1 自组装现象与概念

1.2.2 静态自组装和动态自组装

1.2.3 自组装实例

1.3 高分子在本体中的自组装行为

1.3.1 嵌段共聚物的微相分离理论

1.3.2 柔性嵌段在本体中的自组装

1.3.3 含有刚性嵌段的共聚物在本体中的自组装

1.3.4 复杂嵌段共聚物在本体中的自组装

1.4 高分子在溶液中的自组装行为

1.4.1 溶液中自组装的热力学本质

1.4.2 溶液中嵌段共聚物的组装策略

1.4.2.1 选择性溶剂法

1.4.2.2 温度改变诱导的胶束化

1.4.2.3 pH和离子强度改变诱导的胶束化

1.4.2.4 多重刺激诱导的胶束化

1.4.2.5 小分子诱导的胶束化

1.4.2.6 大分子诱导的胶束化

1.4.2.7 络合诱导的胶束化

1.4.2.8 化学反应诱导的胶束化

1.4.3 溶液中胶束化的机理

1.4.4 胶束核的运动性

1.4.5 聚合物胶束的形貌

1.4.5.1 影响柔性链嵌段共聚物组装体形貌的因素

1.4.5.2 含非柔性链的嵌段共聚物的形貌

1.5 聚合物空心球

1.5.1 乳液聚合的方法制备空心球

1.5.2 自组装的方法制备空心球

1.5.3 聚合物空心球的应用简介

1.6 聚合物微凝胶

1.6.1 微凝胶的概念

1.6.2 微凝胶的制备方法

1.6.3 微凝胶的刺激响应性

1.6.4 微凝胶在载体方面的应用

1.7 本论文主要内容

参考文献

第二章利用白蛋白和溶菌酶自组装制备纳米凝胶

2.1 序言

2.1.1 生物大分子自组装概述

2.1.2 蛋白质化学基础

2.1.3 球状食品蛋白质的凝胶化理论

2.1.4 卵清白蛋白和卵清溶菌酶简介

2.2 实验部分

2.2.1 材料

2.2.2 白蛋白/溶菌酶组装体的制备

2.2.3 光散射测试

2.2.3.1 测试原理简介

2.2.3.2 散射角为90°时的动态光散射测试

2.2.3.3 其他角度的动态光散射测试

2.2.3.4 静态光散射测试

2.2.4 石英晶体微天平测试

2.2.5 原子力显微镜测试

2.2.6 透射电镜观察

2.2.7 ζ电位测试

2.2.8 凝胶电泳分析

2.2.9 差示扫描量热分析

2.2.10 圆二色性分析

2.2.11 稳态荧光测试

2.3 结果与讨论

2.3.1 组装条件的探索

2.3.1.1 制备方式的确定

2.3.1.2 溶液pH值的影响

2.3.1.3 白蛋白和溶菌酶摩尔比例的影响

2.3.1.4 加热温度和加热时间的影响

2.3.1.5 搅拌时间的影响

2.3.2 组装体的稳定性

2.3.3 组装体的形貌和结构

2.3.3.1 纳米微粒的形貌

2.3.3.2 纳米微粒的水凝胶结构

2.3.3.3 纳米凝胶的核壳结构

2.3.3.4 纳米凝胶内部和纳米凝胶间的相互作用力分析

2.3.4 组装机理的探讨

2.3.5 组装体在药物载体方面应用前景分析

2.4 纳米凝胶制备方法的通用性

2.4.1 牛血清蛋白和溶菌酶的自组装

2.4.2 卵清白蛋白和卵转铁球蛋白的自组装

2.4.3 α_s-酪蛋白和卵转铁球蛋白的自组装

2.5 全pH稳定的纳米水凝胶制备

2.6 本章小结

参考文献

第三章利用壳聚糖和白蛋白制备pH敏感的纳米凝胶

3.1 序言

3.2 试验部分

3.2.1 材料

3.2.2 纳米凝胶的制备

3.2.3 动态光散射测试

3.2.4 ζ电位测试

3.2.5 浊度测试

3.2.6 扫描电镜观察

3.2.7 透射电镜观察

3.2.8 芘的稳态荧光测试

3.3 结果与讨论

3.3.1 纳米凝胶的制备条件

3.3.1.1 ζ电位研究

3.3.1.2 加热条件的影响

3.3.1.3 pH值的影响

3.3.1.4 壳聚糖和白蛋白质量比的影响

3.3.2 纳米凝胶的稳定性

3.3.3 纳米凝胶的形貌和结构

3.3.3.1 凝胶粒子的形貌

3.3.3.2 凝胶粒子的结构

3.3.4 纳米凝胶的形成机理

3.3.5 纳米凝胶的pH敏感性

3.3.6 纳米凝胶的疏水/亲水性研究

3.4 本章小结

参考文献

第四章 β-酪蛋白-β-葡聚糖对溶菌酶的负载和释放研究

4.1 序言

4.2 实验部分

4.2.1 原料

4.2.2 Maillard反应

4.2.3 胶束样品的制备

4.2.4 ζ电位测试

4.2.5 动态光散射测试

4.2.6 溶菌酶活性的测定

4.3 结果与讨论

4.3.1 Maillard反应结果分析

4.3.2 葡聚糖接枝的β-酪蛋白对溶菌酶的负载研究

4.3.3 溶菌酶的释放条件研究

4.3.4 溶菌酶活性的研究

4.3.5 载体稳定性的研究

4.4 本章小结

参考文献

作者简介

后记

发布时间: 2007-06-28

基于食品蛋白和天然多糖的生物大分子自组装

猜你喜欢