虎杖颗粒愈伤组织悬浮培养体系建立与白藜芦醇的生物合成、调控及生物转化研究

论文题目: 虎杖颗粒愈伤组织悬浮培养体系建立与白藜芦醇的生物合成、调控及生物转化研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 曹庸

导师: 肖浪涛

关键词: 虎杖,白藜芦醇,组织化学定位,内源激素,颗粒愈伤组织悬浮培养,生物反应器,无机元素,生物转化

文献来源: 湖南农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 虎杖（Polygonum cuspidatum Sie bet Zucc）为蓼科蓼属草质状亚灌木。广泛分布于辽宁、陕西、甘肃、四川、贵州、云南及华东、中南等省区,是我国传统的中草药,现代药学研究证明虎杖具有多种药理作用。虎杖中的有效成分之一的白藜芦醇（Resveratrol,略写为Resv）具有许多功能作用,主要表现在抗癌作用、抗心血管疾病、平衡女性雌激素等三个方面,受到药学界广泛重视,具有重要的研究和开发价值。随着对虎杖次生代谢产物及其活性成分的深入研究,发现在众多植物中虎杖白藜芦醇的含量最高。本文以虎杖特别是其根状茎芽为外植体诱导愈伤组织,并对颗粒愈伤组织悬浮培养体系建立及其白藜芦醇的生物合成、调控与生物转化、白藜芦醇含量差异等方面进行了较全面而系统地研究。研究结果如下: 1.种质资源研究对武陵山区不同地域、同一地方采集的虎杖植株进行白藜芦醇含量比较测定,结果表明:白藜芦醇含量有较大的差异。通过对30个不同地区、不同地理条件的虎杖生长环境调查,发现最佳生长条件为:坡向南坡、坡位上坡,土壤种类黄棕壤,土壤质地粘土,土壤母质板页岩,郁蔽度有零星光照。虎杖白藜芦醇含量最高的时期为8～9月。白藜芦醇主要集中在根状茎中,其他部位很少;根状茎芽的含量异常丰富,是组织培养诱导愈伤组织并建立愈伤组织悬浮培养首选的外植体。 2.植物组织化学定位与定量研究植物组织化学定位与定量:建立了一套虎杖白藜芦醇组织化学定位和检测的方法。特别是为建立颗粒愈伤组织悬浮培养体系提供理论和技术支持平台。通过染色后的明场显微镜观察以及AlCl3处理、水处理后荧光显微观察等方法研究,结果表明:虎杖白藜芦醇主要分布在纤维化程度高的维管组织,即韧皮部的韧皮纤维,木质部导管、木纤维细胞,以及周皮木栓层细胞。悬浮颗粒愈伤组织白藜芦醇主要积累在减慢期;白藜芦醇大量分布在愈伤组织周皮及维管组织节结上,

论文目录:

第一章概论

1 立题的目的与意义

2 白藜芦醇的国内外研究现状、水平和发展趋势

2.1 白藜芦醇的结构、植物中的分布、药理作用

2.1.1 白藜芦醇的结构

2.1.2 白藜芦醇在植物中的分布

2.1.3 药理作用

2.2 植物药用活性成分在不同组织部位的含量及其在组织细胞中的定位研究

2.3 矿质营养、植物内源激素的变化对植物药用活性物质形成的影响

2.4 植物细胞培养生产次生代谢物质研究进展

2.5 微生物转化研究

2.6 白藜芦醇生物合成研究

第二章虎杖白藜芦醇组织化学定位、含量检测及高含量资源的筛选

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 不同地区虎杖白藜芦醇的提取

1.2.2 虎杖不同组织部位白藜芦醇的提取

1.2.3 高效液相色谱法测定白藜芦醇的含量

1.2.4 制片条件的选择与制片方法

1.2.5 荧光显微观察

1.2.6 荧光分光光度计检测切片中白藜芦醇的含量

2 结果与分析

2.1 HPLC测定白藜芦醇标样及虎杖样品中白藜芦醇

2.2 虎杖中各组织部位的白藜芦醇含量测定

2.3 不同采集月份的虎杖鲜根状茎中白藜芦醇含量变化

2.4 虎杖鲜根茎与鲜根茎芽、干根茎粉中白藜芦醇含量的比较

2.5 不同地理条件对虎杖白藜芦醇的含量

2.6 显微镜观察结果

2.6.1 明场显微观察

2.6.2 荧光显微观察

2.7 HPLC检测根茎中组织部位的白藜芦醇含量

2.8 荧光分光光度计检测虎杖根茎中白藜芦醇

3.讨论

第三章影响虎杖根状茎白藜芦醇含量的因素探讨

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 虎杖白藜芦醇的高效液相测定

1.2.2 虎杖根状茎中无机元素的分析

1.2.3 气象因素

1.2.4 植物激素检测波长的选择和分离条件

1.2.5 内源激素的提取、纯化及测定

1.2.6 标准溶液的配制

1.2.7 相关分析与主成分分析方法

2 结果与分析

2.1 高效液相条件的确定

2.1.1 波长的选定

2.1.2 洗脱条件的选择

2.1.3 梯度洗脱条件

2.1.4 线性关系的测定

2.2 内源激素对虎杖根状茎白藜芦醇含量的影响

2.2.1 虎杖中各月份内源激素与白藜芦醇含量

2.2.2 植物内源激素与白藜芦醇的含量变化分析

2.2.3 内源激素与白藜芦醇含量的相对集中性和离散性

2.2.4 内源激素与白藜芦醇含量的相关系数分析

2.2.5 内源激素与白藜芦醇含量的主成分分析

2.3 无机元素、气象因素对虎杖白藜芦醇含量变化的影响

2.3.1 无机元素对虎杖白藜芦醇含量变化的影响

2.3.2 虎杖根状茎中各月白藜芦醇的含量(HPLC法)与气象要素的统计

2.3.3 各分析指标的相对集中性和离散性

2.3.4 各分析指标的相关性分析

2.3.5 无机元素、气象因素对虎杖白藜芦醇含量的主成分分析

2.3.6 白藜芦醇量的动态变化与主成分的多元相关与回归分析

3 讨论

第四章虎杖愈伤组织诱导及颗粒状愈伤组织悬浮培养体系的的建立

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织适宜培养基的筛选

1.2.2 愈伤组织生长曲线

1.2.3 愈伤组织白藜芦醇提取与测定

1.2.4 愈伤组织白藜芦醇变化曲线的测定

1.2.5 虎杖颗粒状愈伤组织悬浮培养体系的建立

1.2.6 虎杖颗粒愈伤组织悬浮培养生长状态的观察与测定

1.2.7 虎杖颗粒状愈伤组织悬浮培养

1.2.8 颗粒愈伤组织悬浮培养白藜芦醇的提取及含量测定

2.结果与分析

2.1 不同基本培养基上的诱导实验

2.2 激素种类及水平的诱导比较实验

2.3 虎杖根状茎和根状茎芽在不同激素水平培养基上的诱导效果比较

2.4 虎杖茎和叶在不同培养基上的诱导实验

2.5 不同材料诱导的愈伤组织中白藜芦醇含量的检测

2.6虎杖根茎芽愈伤组织中高产白票芦醇细胞的筛选

2.7 愈伤组织生长曲线及生长状况

2.8 愈伤组织生长曲线中不同时期白藜芦醇的含量变化

2.9 细胞悬浮培养生长的正交实验

2.10 虎杖颗粒状愈伤组织悬浮培养过程中悬浮液各种理化因子的变化

2.10.1 悬浮培养液中溶氧水平、pH、电导率、渗透压的变化

2.10.2 虎杖悬浮细胞的生长和白藜芦醇的变化情况

3.讨论

第五章 2L气升式生物反应器悬浮扩大培养虎杖颗粒愈伤组织研究

1、材料与方法

1.1.材料

1.2 方法

1.2.1 生物反应器培养虎杖细胞

1.2.2 虎杖悬浮细胞培养液各种生理指标的测定

1.2.3 苯丙氨酸转氨酶活性测定

1.2.4 过氧化物酶活力的测定

1.2.5 总糖含量的测定

1.2.6 蛋白质含量的测定

1.2.7 胞内胞外白藜芦醇的提取与检测

2.结果与分析

2.1 细胞生长与细胞生长态势的关系

2.1.1 培养液中糖利用动态

2.1.2 培养液中pH值变化

2.1.3 培养液中溶氧水平的变化

2.1.4 培养液中渗透压的变化

2.1.5 培养液中电导率的变化

2.1.6 培养液中苯丙氨酸转氨酶(PAL)的活性

2.1.7 培养液中过氧化物酶的活力与悬浮细胞生长的关系

2.1.8 培养液中蛋白质含量的变化

2.1.9 悬浮细胞生物量的变化

2.1.10 胞内外白藜芦醇含量的变化

2.1.11 不同大小细胞团中白藜芦醇及其类似物含量的区别

3.讨论

第六章虎杖白藜芦醇的生物合成途径探讨

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 苯丙氨酸作为前体添加调控实验

1.2.2 白藜芦醇类似物调控实验

1.2.3 苯丙氨酸与白藜芦醇类似物添加调控中，培养液各种生理生化指标测定

2 结果与分析

2.1 苯丙氨酸(Phe)作为前体的研究

2.1.1 Phe诱导子对虎杖悬浮细胞液pH和溶氧水平(DO)的影响

2.1.2 Phe诱导子对悬浮培养体系电导率和渗透压的影响

2.1.3 Phe诱导子对培养液POD和苯丙氨酸转氨酶(PAL)的影响

2.1.4 Phe诱导子对悬浮培养液碳源浓度的影响

2.1.5 Phe前体对虎杖悬浮细胞生长的影响

2.1.6 苯丙氨酸诱导子对白藜芦醇的影响

2.2 白藜芦醇类似物调控

2.2.1 细胞生长量及培养液中pH值的变化

2.2.2 培养液中溶氧水平和电导率的变化

2.2.3 培养液渗透压和POD的变化

2.2.4 培养液中碳源和PAL的变化

2.2.5 白藜芦醇类似物及白藜芦醇的变化

3 讨论

第七章诱导因子对虎杖白藜芦醇产生与积累的调控

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 方法

1.2.1 无机元素的调控

1.2.2 外源生长物质KT的调控

1.2.3 微生物诱导因子的添加

1.2.4 紫外照射诱变

1.2.5 细胞生理态势指标的测定

1.2.6 蛋白质含量的测定

1.2.7 糖含量的测定

1.2.8 过氧化物酶(POD)活性分析

1.2.9 苯丙氨酸转氨酶活性的测定

1.2.10 细胞内、外白藜芦醇的提取及含量的测定

2 结果与分析

2.1 无机元素的调控

2.1.1 Mg~(2+)的影响

2.1.2 Cu~(2+)的影响

2.2 外源生长物质激动素(KT)的调控

2.2.1.悬浮培养液中溶氧水平及电导率的变化

2.2.2 悬浮培养液中渗透压和pH的变化

2.2.3 悬浮培养液中过氧化物酶及糖变化

2.2.4 悬浮细胞的生长和白藜芦醇积累

2.3 微生物诱导因子的调控

2.3.1 细胞培养液中pH及溶氧水平的变化

2.3.2 细胞培养液中电导率和渗透压的变化

2.3.3 细胞培养液中POD和蛋白质的变化

2.3.4 细胞培养液中苯丙氨酸转氨酶(PAL)和碳源的变化

2.3.5 微生物诱导因子对白藜芦醇的影响

2.4 紫外照射诱变

2.4.1 培养液中溶氧水平和电导率的变化

2.4.2 培养液中渗透压和pH的变化

2.4.3 培养液中蛋白质和糖的变化

2.4.4 培养液中PAL和POD的变化

2.4.5 紫外照射对悬浮细胞的生长和白藜芦醇积累的影响

3 讨论

3.1 无机元素调控影响

3.2 外源生长物质激动素(KT)的调控

3.3 微生物诱导的影响

3.4 紫外诱变的影响

第八章利用生物转化技术提高虎杖中白藜芦醇的含量及其转化机理探讨

1、材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 微生物诱导虎杖白藜芦醇前体物转化成白藜芦醇

1.2.2 诱导虎杖白藜芦醇类似物生物转化为白藜芦醇的条件

1.2.3 高效转化虎杖愈伤组织材料中白藜芦醇的研究

1.2.4 白藜芦醇类似物的提取与分离

1.2.5 白藜芦醇类似物结构鉴定

2 结果分析

2.1 虎杖白藜芦醇前体物的微生物转化

2.2 微生物转化条件

2.3 虎杖愈伤组织中白藜芦醇类似物的高效转化

2.4 白藜芦醇类似物的提取、分离及结构鉴定

2.5 白藜芦醇类似物的结构

3 讨论

缩略词表

全文总结

参考文献

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致谢

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发布时间: 2005-08-15

参考文献

[1].四川小麦转基因技术体系构建及应用研究[D]. 张志清.四川农业大学2004
[2].棉花体细胞胚胎发生的调控及其抗病虫基因的遗传转化[D]. 吴家和.华中农业大学2004
[3].小麦遗传转化参数优化及其应用研究[D]. 武丽敏.四川农业大学2005
[4].Genetic Transformation of Wheat for Salt Tolerance[D]. Abdul Razzaq.河北农业大学2005
[5].籼稻成熟胚再生体系的建立及反义waxy基因转化籼稻的研究[D]. 吴顺.湖南农业大学2005
[6].羊草细胞差异表达基因分析与遗传转化方法研究[D]. 舒庆艳.中国科学院研究生院（植物研究所）2005
[7].高产黄酮苷和萜内酯银杏细胞系选育及黄酮苷积累调控的研究[D]. 刘佳佳.华南理工大学1999
[8].原生质体融合提高玫瑰茄细胞生长速率的研究[D]. 廖劲松.华南理工大学2004
[9].剑麻组织和细胞培养诱导蛋白酶的研究[D]. 李斌.华南理工大学1998
[10].农杆菌介导玉米愈伤遗传转化体系优化及基因工程雄性不育系初步研究[D]. 杨爱国.四川农业大学2006

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