IGFBP-3在斑马鱼胚胎发育中的功能

论文题目: IGFBP-3在斑马鱼胚胎发育中的功能

论文类型: 博士论文

论文专业: 海洋生物学

作者: 李云

导师: 相建海,段存明

关键词: 类胰岛素生长因子结合蛋白,斑马鱼,发育,胚胎发生,内耳,颌面骨骼,感光器官

文献来源: 中国科学院研究生院（海洋研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 类胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)-3 是血液中主要的 IGF 载体蛋白。 IGFBP-3 延长了血液中的 IGFs 的半衰期并阻止了他们的潜在的低血糖效应。 IGFBP-3 也表达在胎儿和成体阶段的外周组织中。 体外试验表明， IGFBP-3不仅能调节 IGF 的生理作用， 还拥有不依赖于 IGF 的独立作用， 提示局部表达的 IGFBP-3 也具有旁分泌和自分泌的功能。 然而， IGFBP-3 的在体功能尚不清楚。 本研究使用斑马鱼模型探索了 IGFBP-3 的在胚胎发育中的功能。 IGFBP-3 mRNA 最早表达在迁移的头神经嵴细胞， 随后表达在胚胎的咽弓和胸鳍原基。 IGFBP-3 mRNA 持续而强烈地表达在发育中的内耳， 它也表达在眼睛的视杆和部分视网膜细胞， 松果腺以及脑垂体前部、 中脑脑盖和下丘脑的基底中央等脑组织。 为了研究 IGFBP-3 在这些组织中的功能， 我们使用 morpholino 修饰反义寡核苷酸(MOs) 阻断 IGFBP-3 基因产物的表达。 IGFBP-3 knockdown 胚胎的咽弓骨骼形态发生滞后， 咽弓软骨分化明显减少。 同时， IGFBP-3 knockdown 也引起内耳、 眼睛和胸鳍原基大小显著下降、 干扰了内耳毛细胞和视神经的分化及半规管和松果腺的形成。 进一步， 我们在knockdown胚胎中导入并表达 MO-抗性形式的 IGFBP-3“营救”了 MO-引起的缺陷。 这些新的发现， 首次提供在体证据证明 IGFBP-3 在调节斑马鱼咽弓、 内耳的生长发育、 视神经和运动神经的分化过程中起着重要作用， 并参与调节眼睛、 松果腺、 胸鳍的发育过程。

论文目录:

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英文摘要

引言

第一章 文献综述

1.1 类胰岛素生长因子 IGF 信号转导系统的研究进展

1.1.1 IGF 的发现

1.1.2 哺乳动物 IGF 信号系统

1.1.2.1 IGFs

1.1.2.2 IGFs 受体

1.1.2.3 IGFBPs

1.1.3 鱼类的 IGF 系统

1.1.3.1 IGFs的结构功能和发育表达

1.1.3.2 IGF-I 受体和下游信号网络

1.1.3.3 IGFBPs 的结构表达和生理作用

1.1.3.4 无颌类和脊索动物的 IGF 胰岛素/IGF超家族的进化

1.1.3.5 小结

1.2 新的模式生物---斑马鱼

1.2.1 斑马鱼作为模式生物的优点

1.2.2 研究的起源

1.2.3 研究群体的出现

1.2.4 跨入分子生物学时代

1.2.5 斑马鱼模型的应用

1.2.6 小结

1.3 Morpholino基因沉默技术

1.3.1 Morpholino 反义核酸阻断信使 mRNA的翻译

1.3.2 用 Morpholino 技术模拟突变体的表型

1.3.3 拟表型的变异

1.3.4 非 morpholino 效应

1.3.5 寡聚核苷酸的稳定性

1.3.6 Morpholino的应用

第二章 IGFBP-3 的时空表达

2.1 RT-PCR 分析 IGFBP-3 在斑马鱼胚胎和成体的表达

2.1.1 材料和方法

2.1.1.1 材料

2.1.1.2 实验动物

2.1.1.3 方法

2.1.1.3.1 总 RNA的提取

2.1.1.3.2 RT-PCR

2.1.2 结果

2.1.2.1 IGFBP-3 mRNA在胚胎的时间表达和成体的空间表达

2.2 整体原位杂交分析 IGFBP-3mRNA 在胚胎发育中的表达

2.2.1 实验动物

2.2.2 DIG-标记 RNA探针的制备

2.2.2.1 质粒 DNA的分离纯化和线性化

2.2.2.2 DIG-标记 RNA探针的合成

2.2.3 胚胎整体原位杂交

2.2.4 结果

2.2.4.1 IGFBP-3 mRNA在胚胎发育中的时空表达

2.3 讨论

第三章 IGFBP-3 对咽弓和内耳发育的调节

3.1 实验动物

3.2 方法

3.2.1 DIG-标记 RNA探针的制备

3.2.2 整体原位杂交分析

3.2.3 蛋白质免疫印迹

3.2.3.1 SDSPAGE 电泳

3.2.3.2 Western blot

3.2.3.3 ECL 反应

3.2.4 荧光标记微管蛋白免疫细胞化学 ICC

3.2.5 Morpholino knockdown

3.2.6 pCS2+ 表达载体

3.2.7 检验 IGFBP-3 morpholino 功效的载体构建

3.2.8 亚克隆构建 IGFBP-3 表达载体

3.2.9 软骨细胞标记 AlcianBluestaining

3.2.10 统计分析

3.3 结果

3.3.1 IGFBP-3 morpholino功效和特异性的验证

3.3.2 IGFBP-3 knockdown对咽弓形成和分化的影响

3.3.3 IGFBP-3 knockdown对听囊形成和分化的影响

3.3.4 IGFBP-3 Knockdown 对脑 心脏和血管形成的影响

3.3.5 MO-抗性的 IGFBP-3 表达载体的构建和 mRNA功效检验

3.3.6 过表达 MO-抗性的 IGFBP-3 对 knockdown 导致缺陷的营救

3.4 讨论

第四章 IGFBP-3 在调节感光器官和神经组织发育中的作用

4.1 方法

4.1.1 胚胎整体原位杂交分析

4.1.2 荧光标记神经元免疫细胞化学

4.2 结果

4.2.1 IGFBP-3 靶向 knockdown 眼睛发育的影响

4.2.2 IGFBP-3knockdown 视网膜神经节轴突分化的影响

4.2.3 IGFBP-3knockdown 对松果腺形成的影响

4.2.4 IGFBP-3 knockdown对肌肉运动神经元分化的影响

4.2.5 IGFBP-3knockdown 对头部和胸鳍大小的影响

4.2.6 IGFBP-3 knockdown 对端脑和肌肉发育的影响

4.2.7 外源 IGFBP-3 表达对视原基模式改变的恢复作用

4.3 讨论

结论

附录

参考文献

发表文章

致谢

发布时间: 2005-04-18

参考文献

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