平滑肌肌球蛋白轻链激酶全长及ATP结合位点突变体的表达和活性分析

论文摘要

目的:平滑肌肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kianse, MLCK）作为调节平滑肌收缩的关键酶,可以通过与钙离子（Ca2+）/钙调蛋白（Calmodulin, CaM）的结合,使肌球蛋白20kD轻链磷酸化,进而激活肌球蛋白的ATP酶活性引起平滑肌收缩。MLCK作为一种多功能调节蛋白质,除具有磷酸化肌球蛋白20kD轻链的激酶作用外,N末端还具有与肌动蛋白结合活性和C末端与肌球蛋白结合的非激酶活性作用。MLCK的非激酶作用可能在平滑肌收缩与舒张的调节过程中产生一定影响。为了更好地研究MLCK分子的非激酶作用以及激酶与非激酶两者的关系,本实验利用大肠杆菌表达系统大量表达并纯化出完整的MLCK分子,并对其ATP结合位点进行定点突变,获得无激酶活性的MLCK突变体。通过检测重组MLCK分子对磷酸化与非磷酸化肌球蛋白Mg2 +-ATP酶（简称ATP酶）活性的作用及重组MLCK分子对体外肌丝运动速度的影响,进一步证明了MLCK的非激酶调节作用。本研究同时也为深入研究MLCK分子的多功能提供了新的思路和方法。方法:利用编码MLCK全长的pCold I表达载体在大肠杆菌中进行表达;应用SDS-PAGE鉴定表达的重组MLCK分子;Glycerol-PAGE鉴定肌球蛋白磷酸化水平;运用亲和层析及凝胶过滤分离纯化重组的MLCK;应用孔雀绿方法检测重组MLCK对肌球蛋白ATP酶活性的影响;体外检测重组MLCK对肌动蛋白肌丝运动的作用（ in vitro motility assay）。结果:实验结果显示重组MLCK（野生型）和MLCK/△ATP（突变型）在大肠杆菌中以可溶的形式大量表达;经CaM-Sepharose 4B和Superose 6 HR纯化,SDS-PAGE鉴定得到单一的表达条带。Glycerol-PAGE显示重组MLCK（野生型）具有磷酸化肌球蛋白轻链的激酶活性;而MLCK/△ATP（突变型）则失去磷酸化肌球蛋白轻链的激酶活性。应用孔雀绿方法测定不同浓度MLCK对非磷酸化与磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性的影响。结果表明:重组MLCK（野生型）和MLCK/△ATP（突变型）均可以在非钙条件下激活非磷酸化肌球蛋白ATP酶活性,抑制磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性,而且激活与抑制作用均随着MLCK浓度的增加而增大,呈量效关系。在体外肌动蛋白肌丝运动实验中,随着MLCK浓度的增加,肌丝的运动速度呈明显递减趋势。重组MLCK（野生型）和MLCK/△ATP（突变型）的比较表明二者在对肌球蛋白的ATP酶活性的作用上没有显著差异（P>0.05）。在体外肌动蛋白肌丝运动实验中,MLCK/△ATP（突变型）对肌丝运动速度的抑制作用要强于重组MLCK（野生型） （P<0.05）。结论:本实验得出如下结论:1.重组MLCK（野生型）和MLCK/△ATP（突变型）均可以在大肠杆菌中以可溶形式大量表达。2.SDS-PAGE结果显示重组全长MLCK可以通过亲和层析和凝胶过滤纯化得到单一的条带。3.Glycerol-PAGE显示MLCK/△ATP（突变型）失去磷酸化肌球蛋白轻链的激酶活性。4.重组MLCK（野生型）和MLCK/△ATP（突变型）均可以在非钙条件下激活非磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性,抑制磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性,二者的作用无显著性差异（P>0.05）。5.体外肌丝运动研究表明,重组MLCK（野生型）和MLCK/△ATP（突变型）均可以抑制体外肌动蛋白肌丝运动的速度,MLCK/△ATP（突变型）对肌丝运动速度的抑制作用较重组MLCK（野生型）更显著（P<0.05）。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料和方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢