论文摘要
研究背景：脓毒症是是目前患病率和死亡率最高的疾病之一,欧美国家脓毒症的患病率在10%以上,我国缺乏相应资料,但根据抗生素使用情况判断,其患病率远在欧美国家之上,脓毒症成为严重威胁着人类健康的最主要疾病之一；为降低脓毒症的患病率和病死率,早在2002年就由多个国家学会共同提出了"surviving sepsis campaign",并根据大量循证医学证据和广泛论证,提出了"sepsis resuscitation bundles"和‘’Sepsis management bundle",从2008年起在世界各地进行推广；经过大量的努力,同时伴随诊疗技术的不断提高,2010年数据分析显示脓毒症的病死率仍在30.8%。如何降低其发病率和病死率是当今研究的热点和难点。研究证明,毛细血管内皮细胞功能异常及结构受损,导致内皮细胞脱落变形、凝血功能异常、毛细血管渗漏等在脓毒症的病情进展中其重要作用,成年内皮细胞的自我增殖和修复能力有限,内皮祖细胞是出生后血管内皮损伤修复的重要细胞,研究表明循环内皮祖细胞数量和功能直接影响到脓毒症患者的预后。细菌脂多糖是革兰氏阴性杆菌的主要致病原,实验中经常用LPS体内注射模拟机体感染过程；3-羟-3-甲基戊二酸辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA）还原酶抑制剂（他汀类药物）通过抑制HMG-CoA还原酶的活性,而抑制胆固醇的生成、降低血胆固醇的水平,最近研究表明,在有效地调节血脂水平外,还具有抑制平滑肌增生和血小板聚集以及抑制炎症反应等作用,有研究证明他汀类药物还能促进血管新生和内皮损伤后的修复过程,而且已经证实EPCs在该过程中扮演了重要角色,研究证实他汀类药物有动员内皮祖细胞、提高内皮功能等作用。自2000年Ando首先报道他汀类药物可以改善大鼠脓毒症的生存率后,多个大规模临床观察显示,他汀类药物能降低脓毒症的患病率和病死率,但对于LPS对EPCs数量及功能的影响及他汀类药物对LPS作用下的内皮祖细胞作用未见相关报道。本研究共分三部分进行：1、脐静脉血EPCs分离、培养、鉴定；2、LPS与EPC共孵育后加入辛伐他汀EPC迁移、黏附、增殖情况。3、EPC与辛伐他汀共孵育后加入LPS其迁移、黏附、增殖、凋亡情况。研究目的：1、从脐静脉血获得人EPCs,鉴定并进行体外传代培养。2、将脂多糖（LPS）与人脐血EPCs共孵育,在相应时间点添加不同剂量辛伐他汀,观察LPS对人脐血EPCs增殖、迁移、黏附、凋亡的影响及辛伐他汀干预作用；3、将不同浓度辛伐他汀与人脐血EPCs共孵育,相应时间点加入LPS,观察辛伐他汀对EPCs增殖、迁移、黏附功能的影响,以及预先应用辛伐他汀后LPS对人脐血EPCs增殖、迁移、黏附的影响；通过该研究明确在细胞水平单纯LPS及辛伐他汀对内皮细胞祖的影响,及两者的相互影响,为进一步进行作用机理探讨提供基础。方法：第一部分：采用密度梯度离心法从脐静脉血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板上,诱导培养7天,收集贴壁细胞,通过细胞形态观察及DiI-acLDL、FITC-UEA-I染色激光共聚焦显微镜培养细胞。第二部分：将等量脐静脉血来源EPCs（UCBEPCs）接种到96孔培养板上,随机分为对照组：UCBEPCs与EGM-2MV标准液培养48小时；LPS组,UCBEPCs与GM-2MV标准液和LPS液（100ng/mL）共同培养48小时;LPS+ simv0.1组：UCBEPCs与GM-2MV标准液和LPS液（100ng/mL）共同培养24小时后,加入0.1μmol/L辛伐他汀培养至48小时；LPS+ simv1.0组：UCBEPCs与GM-2MV标准液和LPS液（100ng/mL）共同培养24小时后,加入1.0μmol/L辛伐他汀培养至48小时；LPS+ simv10.0组：UCBEPCs与GM-2MV标准液和LPS液（100ng/mL）共同培养24小时后,加入10.0μmol/L辛伐他汀培养至48小时。应用MTT比色法测定EPCs增殖功能和粘附功能,通过Transwell小室观察EPCs迁移功能。统计学处理：结果中数据以均数±标准差（x±s）表示,资料采用SPSS（16.0版）统计软件进行统计学分析,组间比较用随机取组设计的方差分析,以P<0.05为差异有显著性。第三部分：将等量EPCs接种到96孔培养板上,随机分为对照组：UCBEPCs与EGM-2MV标准液培养48小时；LPS组：UCBEPCs与GM-2MV标准液和LPS液（100ng/mL）共同培养48小时；Sim0.1+LPS组：UCBEPCs与GM-2MV标准液和0.1μmol/L辛伐他汀共同孵育24小时后,加入LPS液（100ng/mL）共同培养至48小时；Siml.O+LPS组：UCBEPCs与GM-2MV标准液和1.0μmol/L辛伐他汀共同孵育24小时后,加入LPS液（100ng/mL）共同培养至48小时；Sim10.0+LPS组：UCBEPCs与GM-2MV标准液和10.0μmol/L辛伐他汀共同孵育24小时后,加入LPS液（100ng/mL）共同培养至48小时；辛伐他汀组：UCBEPCs与GM-2MV标准液和1.0μmol/L辛伐他汀共同孵育48小时。应用MTT比色法测定EPCs增殖功能和粘附功能,通过Transwell小室观察EPCs迁移功能,应用流式细胞仪检测EPCs凋亡情况,细胞凋亡率（AP）计算公式：AP=凋亡细胞数/总检测细胞数。统计学处理：结果中数据以均数±标准差（x±s）表示,资料采用SPSS（16.0版）统计软件进行统计学分析,组间比较用随机取组设计的方差分析,以P<0.05为差异有显著性结果第一部分：经鉴定分离培养细胞为EPCs,经复苏传代见细胞生长良好。第二部分：脐静脉血来源EPCs与LPS共孵育后其增殖、迁移显著降低（P=0.009、P=0.026）,黏附能力也下降,但差异无显著性（P=0.279）。脐静脉EPCs与LPS共孵育后加入不同浓度辛伐他汀,EPCs的增殖、迁移和黏附能力不同程度改善,随辛伐他汀浓度增加,该作用增强,辛伐他汀浓度为1.0μmol/L时EPCs增殖显著改善（P=0.017）,浓度10.0μmol/L时EPCs增殖、黏附、迁移功能,较LPS组均显著改善（P=0.00,P=0.002,P=O.00）,其中黏附和迁移功能较空白对照组显著改善（P=O.039,P=0.000）。第三部分：人EPCs与LPS共孵育后其凋亡率显著增加（12.632±0.5271 vs3.0266±0.5271, P<0.00）。辛伐他汀（1.0umol/L）与EPCs共孵育,EPCs各检测指标与对照组比较均无显著变化。UCBEPCs与不同浓度辛伐他汀孵育后再加入LPS,EPCs的增殖、迁移和黏附能力较LPS组不同程度改善,凋亡率降低,随辛伐他汀浓度增加,该作用增强,辛伐他汀浓度为0.1umol/L EPCs增殖、黏附、迁移功能较LPS组有改善,但无统计学差异（P=0.687、0.501、0.683）,EPCs凋亡率显著降低（9.2750±0.5961 vs 12.632±0.5271,P=0.00）,辛伐他汀浓度为10.0μmol/L时,EPCs增殖、黏附、迁移功能,较LPS组均显著改善（P=0.035,P=0.002,P=0.011）,其中粘附功能较对照组也有显著改善（P=0.039）,不同浓度辛伐他汀与EPCs作用24小时后再与LPS共孵育,其EPCs凋亡率较LPS组均显著改善,但仍高于对照组和辛伐他汀组。结论自脐静脉血可成功分离内皮祖细胞,并可在体外进行传代培养。LPS与UCBEPCs共孵育,可使UCBEPCs增殖和迁移功能显著降低,黏附能力下降,凋亡率显著增加。单纯应用辛伐他汀（1.0umol/L）与UCBEPCs共孵育,对UCBEPCs的增殖、粘附、迁移功能及细胞凋亡无显著影响。辛伐他汀可以改善LPS导致的EPCs增殖、黏附、迁移功能的降低,在研究范围内改善作用随浓度增加而增强。提前应用辛伐他汀与EPCs共孵育,可以显著降低LPS导致的EPCs增殖、黏附、迁移功能的降低,在研究范围内该作用随浓度增加而增强。