水貂生长激素基因重组腺病毒的构建

论文摘要

众所周知,水貂是一种具有很高经济价值的毛皮动物,研究表明,其皮张的大小和皮毛的质量除了与种系,营养水平和饲养管理等因素有关外,还与水貂的生理状况密切相关。水貂生长激素（mink growth hormone,mGH）是由水貂脑垂体前叶细胞分泌的一种蛋白质激素,它是具有广泛的生理功能。实验证明,人工注射动物自身的生长激素,可以明显加快其生长速度,增加体长,提高毛皮质量。但从水貂脑垂体提取天然生长激素产量甚微,难以大范围的应用到生产实践,而基因工程技术和病毒载体的发展为有效的解决这一问题提供了可能。本文主要利用腺病毒载体来生产基因工程水貂生长激素。首先,在本室水貂生长激素基因真核表达载体的相关动物实验结果的基础上,将使水貂增重明显的双启动子调控下的水貂生长激素基因真核表达载体pCMTmGH瞬时转染BHK细胞（仓鼠肾细胞）,48小时后取培养液,浓缩后经SDS-PAGE和免疫印迹检测,结果表明在22KD附近有目的条带,证明该载体可以在真核细胞中表达水貂生长激素。为之后采用双启动子构建水貂生长激素基因重组腺病毒穿梭质粒提供依据。然后,根据需要设计两端分别带有HindⅢ和KpnⅠ酶切位点的水貂生长激素基因特异性PCR引物,将扩增出来的水貂生长激素基因连到pEasy-T载体上,构建成pTmGH克隆载体,经酶切及测序结果表明已成功地扩出水貂生长激素基因并将上述两个酶切位点加到水貂生长激素基因的两端。分别用pCMTmGH上的CMV-MT双启动子和pTmGH上的水貂生长激素基因置换pΔEMTCD上的MT启动子和猪生长激素cDNA,构建成双启动子调控下的水貂生长激素基因重组腺病毒穿梭质粒pΔECMTmGH,经酶切及序列测定,证实已成功构建复制缺陷型的水貂生长激素基因重组腺病毒穿梭质粒。最后,利用人类腺病毒载体,将水貂生长激素基因重组腺病毒穿梭质粒与含有腺病毒DNA大片段的包装质粒pBHGE3共同转染进入293FT细胞,使其在293FT细胞中发生同源重组,经电镜和PCR鉴定,已成功构建出CMV和MT双启动子调控下的水貂生长激素基因重组腺病毒。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 引言
• 1.2 生长激素的研究进展
• 1.3 腺病毒及腺病毒载体的应用
• 1.4 水貂生长激素的研究进展
• 1.5 本论文研究的目的及意义
• 第二章 水貂生长激素真核表达载体在BHK细胞中的暂态表达
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 水貂生长激素基因重组腺病毒穿梭质粒的构建
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 水貂生长激素基因重组腺病毒的构建
• 4.1 实验材料和方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介