脱氢酶活性测定水中活体藻含量的研究

论文摘要

近年来大量工业废水和生活污水的排入,加速了湖泊水库的富营养化进程,其后果是在气候适宜时导致藻类的大量繁殖代谢。由于藻类致臭、密度低、沉淀效果差,给以湖泊水库为水源的饮用水生产带来诸多危害;同时,藻类还产生毒素,对人类的饮水健康构成了严重威胁,因此,研究解决富营养化水源给水处理技术,特别是藻类的去除,直接关系到人们饮水安全健康,成为亟待解决的问题。衡量藻类去除效果的定量检测方法是杀藻除藻研究的必须条件,简便高效的检测方法将有助于该项研究的普及和深入。目前,常用的藻类检测方法如平板计数法、叶绿素a法等步骤繁琐、检测结果不稳定,误差较大。由于这两种方法本身特有的局限性,广泛适用于各种杀藻除藻技术处理后的水样比较困难,尤其是不能定量测定杀藻处理后活体藻的含量。因此,需要有一种更加快速、稳定、实用的测定水中活体藻类含量的方法。为解决这一问题,本文研究探讨了利用检测藻类脱氢酶活性来间接测定活体藻类含量的方法。脱氢酶是一类蛋白质,能够激活某些特殊的氢原子,使这些氢原子被适当的受氢体转移而将原来的物质氧化。在氧化过程中,脱氢酶是作用在代谢物上的第一个酶,为生物体提供必不可少的能量和还原当量。生物体的脱氢酶活性（DHA）在很大程度上反映了生物体的活性状态,能直接表示生物细胞对其基质降解能力的强弱。因此,脱氢酶活性检测被广泛应用于污水生化处理、细菌菌落总数检验、水质毒性检验、土壤污染评价等研究与应用领域。脱氢酶活性可以通过加入人工受氢体TTC（2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride,2,3,5-氯化三苯基四氮唑）的办法进行检测,其最重要的优点是在反应期间使颜色增加和生物学条件下的不可逆性:当微生物细胞内有生物氧化（即脱氢反应）时,TTC便接受氢原子而被还原成红色的TF（Triphenyl Formazane,三苯甲（月朁））,通过红色的TF生成速度来确定脱氢酶活性。本文提出了通过测定藻细胞脱氢酶活性,测定含藻水样中活体藻的含量的方法。选择使用TTC作为显色剂。通过波长扫描确定了TF的最大吸收波长为487nm。研究了藻类不同pH值环境、发色培养温度、发色培养时间、TTC浓度对藻类脱氢酶酶促反应的影响,确定使用0.8%的TTC溶液,在pH值8.4的环境中,于32±1℃水浴中暗处发色培养1h为最佳反应条件。为了使脱氢酶的酶促反应快速终止,保证反应速率计算的准确性,比较了几种终止剂甲醛、乙醇、丙酮、浓硫酸对藻类脱氢酶的灭活效果,实验结果表明,甲醛的效果最好,而且不会像浓硫酸那样使藻类和滤膜变色,影响比色分析。所以,研究选择甲醛为终止剂,加入量为1mL。为了将藻细胞脱氢酶酶促反应中生成的TF萃取出来,克服藻细胞叶绿素的干扰,研究了多种单组份、双组份萃取剂对叶绿素、酶促反应生成的TF的萃取能力,确定以4mL丙酮与5mL石油醚的混合溶剂做萃取剂。脱氢酶活性需要通过酶促反应生成TF的速度来表征,因此需要使用TF标准曲线来定量。制作标准曲线需要使用还原剂将TTC还原为TF。研究中比较了制作标准曲线时两种还原剂硫化钠和连二亚硫酸钠的稳定性与还原反应速度,发现硫化钠做还原剂生成的TF较稳定。同时筛选比较了硫化钠浓度、还原反应时间对TTC还原反应的影响。确定最佳实验条件为1mL 8%硫化钠溶液作还原剂,还原反应时间5分钟。依据上述各反应条件研究结果确定藻类脱氢酶活性的最佳检测条件为:在三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HC1）缓冲溶液、pH=8.4的反应环境中,加入1mL0.8%的TTC溶液,水浴温度32±1℃、发色培养1h,使用双组分萃取剂——4mL丙酮和5mL石油醚的混合溶剂进行萃取。本研究将TTC-脱氢酶活性检测法应用于水体中活体藻类含量的检测之中,水样取10～1000mL,其最低检出浓度为0.004μg TF/mL·h,最佳测定范围为0.014～6.00μg TF/mL·h,在此范围内检测结果有较好的线性关系,回归系数为0.9999。本方法应用于实际水样的活体藻含量测定,测定结果与水样体积线性正相关,相关系数为0.9873;检测从某植物园映日湖、植物园喷泉、山大南区喷泉、植物园内小河四个不同地点取回的水样,在实验室培养0、15、30、45天后,其脱氢酶活性测定结果与叶绿素a法测定结果进行比较,两者线性正相关,相关系数分别为0.9369、0.9728、0.9855、0.9325。本方法应用于杀藻处理后的藻类的检测。当藻类细胞没有发生溶裂,细胞形态没有被破坏时,计数法无法辨别藻体死活;而叶绿素a法在叶绿素还未氧化变色或颜色变化不明显时,无法定量测定活体藻含量,显示杀藻、抑藻效果。本方法克服了上述两方法的缺陷,较好地反应出杀藻剂使用前后活体藻脱氢酶活性的变化,尤其对于那些氧化能力适中、能够抑制藻类活性又不使其细胞内物质溶出造成水体二次污染的化学药剂的杀藻实验研究,其灵敏性优于叶绿素a法。本文从酶作用动力学的角度,对本研究涉及的藻类脱氢酶酶促反应进行了研究探讨,对pH、温度对酶促反应的影响等实验结果进行了酶促反应动力学分析,实验结果基本符合理论解释,为本研究的结果打下了一定的理论基础。总之,本文将脱氢酶活性检测基本原理应用于淡水中活体藻类含量的测定,并系统研究了该方法的发色培养时间、培养温度、终止剂、萃取剂等反应操作条件。与现有的脱氢酶活性检测、淡水藻类含量测定方法相比,本方法具有下列优点:（1）通常的脱氢酶活性检测均使用单组分有机溶剂做萃取剂。本文研究确定使用双组分萃取剂,克服了单组分萃取剂易受藻细胞叶绿素干扰的缺点,提高了对藻细胞内脱氢酶促反应生成的TF的萃取效果。（2）克服了计数法在形态上无法辨别藻体死活、叶绿素a法在叶绿素未变色或变色不明显时无法准确定量测定活体藻含量的缺点,可以更准确定量测定活体藻类含量,解决了一些物理、化学或生物方法杀藻后,水中活体藻含量定量测定的问题。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 藻类对水质的不利影响
• 1.1.2 藻类对自来水厂设施、水处理药剂量的影响
• 1.2 水源水除藻技术及除藻作用机理
• 1.2.1 化学法杀藻
• 1.2.2 生物法除藻
• 1.2.3 物化法除藻
• 1.2.4 物理法灭藻
• 1.3 现有藻类含量的检测方法及其杀藻适用性
• 1.3.1 直接镜检法—计数法
• 1.3.2 DO法
• 1.3.3 浊度法
• 1.3.4 叶绿素a（Chla）法
• 1.3.5 荧光法
• 1.4 本研究选题的意义
• 1.5 脱氢酶对生物体的重要意义
• 1.5.1 酶
• 1.5.2 脱氢酶
• 1.6 脱氢酶活性的检测方法
• 1.6.1 原理
• 1.6.2 检测方法
• 1.7 脱氢酶活性检测在环境监测中的应用
• 1.7.1 废水生化处理
• 1.7.2 细菌菌落总数检验
• 1.7.3 水质毒性检验
• 1.7.4 土壤污染评价
• 1.8 本章小结
• 第二章 藻脱氢酶酶促反应条件的优化选择
• 2.1 主要仪器和试剂
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要试剂及配制
• 2.1.3 水样
• 2.2 方法原理
• 2.3 TF最大吸收波长的确定
• 2.3.1 实验步骤
• 2.3.2 结果与讨论
• 2.4 脱氢酶酶促反应环境的PH值
• 2.4.1 实验步骤
• 2.4.2 结果与讨论
• 2.5 脱氢酶酶促反应的温度
• 2.5.1 实验步骤
• 2.5.2 结果与讨论
• 2.6 脱氢酶酶促反应的时间
• 2.6.1 实验步骤
• 2.6.2 结果与讨论
• 2.7 脱氢酶酶促反应终止剂的选择
• 2.7.1 实验步骤
• 2.7.2 结果与讨论
• 2.8 TTC浓度的确定
• 2.8.1 实验步骤
• 2.8.2 结果与讨论
• 2.9 本章小结
• 第三章 萃取剂的选择
• 3.1 萃取溶液中TF的能力
• 3.1.1 实验步骤
• 3.1.2 结果与讨论
• 3.2 藻类叶绿素对萃取的影响
• 3.2.1 实验步骤
• 3.2.2 结果与讨论
• 3.3 萃取脱氢酶酶促反应生成的TF的能力
• 3.3.1 实验步骤
• 3.3.2 结果与讨论
• 3.4 最佳萃取剂的确定
• 3.4.1 实验步骤
• 3.4.2 结果与讨论
• 3.5 萃取剂安全性和经济性的比较
• 3.6 本章小结
• 第四章 标准曲线制作条件的研究
• 4.1 还原剂的选择
• 4.1.1 实验步骤
• 4.1.2 结果与讨论
• 4.2 还原剂浓度的确定
• 4.2.1 实验步骤
• 4.2.2 结果与讨论
• 4.3 制作标准曲线时反应时间的确定
• 4.3.1 实验步骤
• 4.3.2 结果与讨论
• 4.4 丙酮-石油醚成分比例对萃取效果的影响
• 4.4.1 实验步骤
• 4.4.2 结果与讨论
• 4.5 本章小结
• 第五章 脱氢酶检测法测定活体藻类含量的应用研究
• 5.1 脱氢酶活性表征藻类含量
• 5.2 脱氢酶活性法适用范围、最低检出浓度
• 5.2.1 最低检出浓度
• 5.2.2 最佳测定范围
• 5.3 脱氢酶活性法用于实际水样的测定
• 5.3.1 实验步骤
• 5.3.2 结果与讨论
• 5.4 脱氢酶活性法与叶绿素A法的比较
• 5.4.1 脱氢酶活性法与叶绿素a法相关性
• 5.4.2 脱氢酶活性法与叶绿素a法精密度的比较
• 5.5 杀藻实验后水中活体藻类测定
• 5.5.1 实验步骤
• 5.5.2 结果与讨论
• 5.6 本章小结
• 第六章 藻类脱氢酶酶促反应机理探讨
• 6.1 PH对脱氢酶酶促反应的影响
• 6.2 温度对脱氢酶酶促反应的影响
• 6.3 脱氢酶酶促反应的生物化学探讨
• 6.4 本章小结
• 第七章 结论与建议
• 7.1 结论
• 7.2 建议
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表论文
• 外文论文一
• 外文论文二
• 学位论文评阅及答辩情况表