RNA干扰介导蛋白酶体亚基RC2和泛素连接酶MAFbx基因下调延缓失神经骨骼肌萎缩的基础研究

论文摘要

臂丛神经下干、正中神经、尺神经损伤后导致的手内在肌萎缩的治疗是周围神经领域的一大难题，手内肌功能的丧失实质上意味着上肢核心功能的丧失，给患者及其家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担，因此，加强基础研究、揭示肌萎缩本质、寻找有效方法有着重要的理论和现实意义。 骨骼肌在失神经支配后早期出现的快速萎缩的事实，从蛋白代谢的角度分析，就是骨骼肌中蛋白代谢的动态平衡被打破了，蛋白降解占据了主导地位，经过近十几年的基础研究，已经明确了泛素-蛋白酶体蛋白水解途径在这一过程中占具着主导地位，失神经后，其相关基因表达上调，活性增强，导致骨骼肌中的蛋白降解加速，最终出现骨骼肌的萎缩。RNA干扰是一种新的阻抑基因表达的技术，通过导入一段与内源性靶基因同源的双链RNA序列，可以特异性的使靶基因的mRNA降解，进而使靶基因编码的蛋白表达缺失或下调，受此启发，本课题尝试采用RNA干扰技术来下调泛素-蛋白酶体途径中编码蛋白酶体亚基RC2和泛素连接酶MAFbx基因的表达，借此抑制失神经后骨骼肌中蛋白的高分解代谢，探讨其延缓骨骼肌萎缩的疗效，为失神经骨骼肌萎缩寻找新的治疗方法。 第一部分 蛋白酶体亚基RC2和泛素连接酶MAFbx基因在失神经骨骼肌中的变化規律及其意义 目的 研究蛋白酶体亚基RC2和泛素连接酶MAFbx两基因在失神经骨骼肌中的变化规律及其意义，为RNAi介导的基因治疗提供干预时间点。 方法 选用雌性SD大鼠48只，建立右下肢腓肠肌失神经支配模型，随机分为8组，每组6只，术后0天为对照组，术后1、2、3、4、5、6、14天为实验组，采用实时定量PCR检测RC2和MAFbx基因mRNA在失神经后不同时间点的变化规律，相对定量法分析其表达变化；使用Western印迹检测RC2在蛋白水平的变化规律，并对其灰度进行半定量分析。 结果 1、实时定量PCR分析结果显示RC2基因的mRNA从失神经后第1天开始表达上调，3天时达到高峰，为正常的4.98倍，随后逐渐下降，14天时降为正常的0.42倍；各组与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。2、Western印迹灰度分析结果显示RC2在蛋白水平的变化与mRNA水平有着相同的趋势，但是变化幅度较转录水平为低；失神经3天时达到高峰，为正常对照的2.70倍，随后缓慢下降，14天时降为正常对照的0.35倍；失神经术后第1天，第6天与正常对照组相比无显著性差异（P＞0.05），第2天到第5天，第14天与正常对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。3、实时定量PCR分析结果显示MAFbx的mRNA表达从失神经后第1天开始上调，2d达到高峰，为对照组的15.3倍，随后逐渐缓慢下降，在一周内保持在较高的水平，6d时为对照组的8.7倍，14d时为对照组的3.7倍；各组与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 RC2和MAFbx两基因在失神经骨骼肌中表达上调，提示了二者在失神经早期骨骼肌的快速萎缩中可能占有重要作用；而两者具有的不同的变化规律，表明了它们在骨骼肌早期的快速萎缩中发挥着不同的作用；采用RNAi抑制失神经后RC2和MAFbx基因的表达使其下调，来延缓失神经骨骼肌萎缩，应该在失神经后越早越好。 第二部分 蛋白酶体亚基RC2和泛素连接酶MAFbx基因的siRNA重组质粒的构建与鉴定 目的 构建RC2和MAFbx基因siRNA重组质粒，为其RNAi体外实验奠定基础。 方法 根据RC2和MAFbx基因的mRNA序列，各设计三对有小发夹结构的干扰序列，即siRNA RC2-Ⅰ、RC2-Ⅱ、RC2-Ⅲ和MAFbx-Ⅰ、MAFbx-Ⅱ、MAFbx-Ⅲ，合成后，经退火成互补双链，再克隆至载体pSilencer2.0-U6中构建重组体，转化Topo10菌株，提取质粒行酶切鉴定后，进行测序分析鉴定。 结果 1、构建的siRNA重组质粒经双酶切后，电泳结果显示环状质粒已被切开，大片段约为3.07kb，而小片段因太小而检测不出来。2、测序结果表明，构建的重组质粒中所插入的siRNA干扰片段序列与所设计的序列完全相符。 结论 成功构建了RC2和MAFbx基因的siRNA重组质粒，为下一步体外实验检测和筛选有效序列奠定了基础。第三部分 RNA干扰技术体外抑制蛋白酶体亚基RC2和泛素连接酶MAFbx基因的表达目的 探讨RNAi技术体外抑制RC2或MAFbx基因表达的效果，筛选最有效的序列，为RNAi介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗奠定基础。 方法 6孔细胞培养版中培养大鼠成肌细胞系L6，使用质粒pEGFP-N1与siRNA重组质粒等比例在Lipofectamine 2000介导下共转染，优化与检测系统的转染效率；将2μg RC2或MAFbx基因SiRNA重组质粒转染L6，转染后48h与72h，采用实时定量PCR检测SiRNA重组质粒对RC2和MAFbx的mRNA的抑制效果，使用Western印迹检测SiRNA重组质粒对RC2蛋白水平的抑制效果。 结果 1、pEGFP-N1与SiRNA重组质粒共转染后48h，荧光显微镜下可见细胞中有大量明亮的绿色荧光表达，显示了系统有着较高的转染效率。2、实时定量PCR分析结果显示，RC2的SiRNA重组质粒转染后48h，其mRNA水平各干扰序列与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）；转染后72h，干扰序列RC2-Ⅰ在mRNA水平明显抑制了RC2的表达，抑制率达75％，与对照组相比有显著性差异（P＜0.05），而RC2-Ⅱ和RC2-Ⅲ未见明显抑制作用（P＞0.05）。3、Western印迹灰度分析分析显示，转染后48h，RC2各干扰序列与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）；转染后72h，可见干扰序列RC2-Ⅰ明显抑制了RC2蛋白的表达，抑制率达68％，与对照组相比有显著性差异（P＜0.05），而RC2-Ⅱ和RC2-Ⅲ未见明显抑制作用（P＞0.05），与mRNA水平的变化基本一致。4、实时定量PCR分析结果显示，转染后48h，干扰序列MAFbx-Ⅰ、MAFbx-Ⅱ和MAFbx-Ⅲ对MFAbx的mRNA的抑制率分别为22％、47％和25％，与对照组相比均有显著性差异（P＜0.05）；转染后72h，干扰序列MAFbx-Ⅰ、MAFbx-Ⅱ和MAFbx-Ⅲ对MFAbx的mRNA的抑制率分别为55％、81％和47％，与对照组相比均有显著性差异（P＜0.05），与48h相比，抑制效应更为明显；但是三对序列的抑制效果存在明显差别，以MAFbx-Ⅱ的抑制效果最为明显。 结论 1、成功筛选出对RC2和MAFbx基因有效的SiRNA重组质粒，即RC2-Ⅰ和MAFbx-Ⅱ，为通过RNAi技术进一步研究其功能以及基因靶向治疗奠定了基础。2、针对目的基因不同位点所设计的siRNA序列在诱导RNAi的作用效力方面存在显著的差异。 第四部分 电穿孔介导蛋白酶体亚基RC2和泛素连接酶HAFbx基因siRNA重组质粒转染延缓大鼠失神经骨骼肌萎缩 目的 探讨电穿孔介导RC2和MAFbx基因siRNA重组质粒转染大鼠失神经骨骼肌，延缓其萎缩的疗效。 方法 1、健康雌性SD大鼠18只，随机分为电穿孔组（EP组）和非电穿孔组（NEP组），每组9只，制作右下肢趾长伸肌失神经支配模型；EP组为将质粒pEGFP-N1溶液50μl（0.8μg／μl）注射入右趾长伸肌后，立即于两侧腱腹交接处给予电穿孔，电穿孔参数为：电场强度为200V／Cm，脉冲100μs，频率1Hz，施加10次脉冲；NEP组仅质粒pEGFP-N1溶液注射；转染后1、2、3周，荧光显微镜下观察趾长伸肌中GFP的表达情况，转染后1周行Western印迹检测趾长伸肌中GFP蛋白的表达情况，检测和优化体内转染效率。2、健康雌性SD大鼠78只，随机分为失神经对照组（CON组）、RC2基因治疗组（RC2组），MAFbx基因治疗组（MAFbx组），每组24只，制作右下肢趾长伸肌失神经支配模型，余6只为正常（Normal）组；分别将含CON、RC2、MAFbx基因的siRNA重组质粒注射入趾长伸肌，之后给予电穿孔，方法同上；治疗后3天实时定量PCR和Western印迹检测各组中RC2或MAFbx基因的mRNA和蛋白的表达变化，治疗后2、3、4周检测各组肌湿重维持率、肌细胞直径和肌细胞截面积，肌细胞超微结构变化以及肌纤维中蛋白含量变化。 结果 1、质粒pEGFP-N1转染后1周，EP组失神经趾长伸肌内可见沿整个肌纤维方向有大量亮绿色荧光表达，2周时，荧光强度稍有减弱，3周时，仍可见有绿色荧光表达，但是强度明显减弱；相比之下，转染后1周，NEP组趾长伸肌内仅见沿质粒注射附近有一条线状亮绿色荧光表达，2周时荧光强度稍有减弱，3周时看不到有绿色荧光表达；转染后1周，Western印迹结果可见EP组GFP蛋白有明显表达，而NEP组内仅有微弱表达。2、治疗3天后，RC2治疗组中RC2的mRNA有所下调，抑制率为CON组的35％（P＜0.05），RC2的蛋白水平有所下调，抑制率为25％，（P＜0.05）；MAFbx治疗组中MAFbx的mRNA有所下调，抑制率为33％（P＜0.05）。3、肌湿重维持率、肌细胞直径、肌细胞横截面积以及肌肉蛋白含量，RC2组在治疗后2周和3周明显优于CON组（P＜0.05），4周时两组间无显著性差异（P＞0.05）；MAFbx组在治疗后2、3、4周均明显优于CON组（P＜0.05）。4、治疗后3周，RC2组和MAFbx组肌纤维超微结构改变较CON为轻；治疗后4周，MAFbx组肌纤维超微结构改变较CON组为轻。 结论 1、活体电穿孔法可以显著提高基因转染的效率，明显优于直接注射法。2、电穿孔介导RC2和MAFbx基因SiRNA重组质粒转染失神经骨骼肌后，通过下调RC2和MAFbx的表达，可以达到降低骨骼肌蛋白的高分解代谢和延缓骨骼肌萎缩的作用，相比之下，MAFbx与失神经早期骨骼肌快速萎缩的关系更为密切。

论文目录

• 英文缩略语注释
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 蛋白酶体亚基RC2和泛素连接酶MAFbx基因在失神经骨骼肌中的变化规律及其意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 蛋白酶体亚基RC2和泛素连接酶MAFbx基因的siRNA重组质粒的构建与鉴定
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 RNA干扰技术体外抑制蛋白酶体亚基RC2和泛素连接酶MAFbx的表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第四部分 电穿孔介导蛋白酶体亚基RC2和泛素连接酶MAFbx基因siRNA重组质粒转染延缓大鼠失神经骨骼肌萎缩
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文小结
• 一、课题创新点
• 二、课题的理论和临床意义
• 三、进一步研究展望
• 文献综述一 RNA干扰及其在基因治疗中的研究进展
• 参考文献
• 文献综述二 泛素-蛋白酶体途径与骨骼肌萎缩
• 参考文献
• 就读博士研究生期间发表论文
• 致谢