GGTase-I或FTase基因敲除在抑制K-ras突变诱导肺癌发生中的分子机制研究

论文摘要

第一部分体内实验背景肺癌是目前发病率和病死率均很高的恶性肿瘤,严重影响着人类健康。肺癌是一种基因病,癌基因激活和抑癌基因失活是其重要的分子事件。因此,阐明肺癌发生的分子机制,从分子水平阻断其发生的相关链接具有极为重要的临床意义。K-ras是目前研究最多的癌基因之一,在许多肿瘤中均存在K-ras基因的扩增或过度表达,其中在肺腺癌中大约有50%左右的患者存在K-ras突变,说明其在肺癌发生、发展中发挥重要作用。深入研究K-ras基因在肺癌发生中的作用机制,尽早阻断其信号系统已成为近年来肺癌研究领域中一个新的热点。大约有100多种细胞内蛋白具有CAAX基序,K-ras基因编码蛋白属于其中的一种,这些蛋白可以进行多种转录后修饰,其中半胱氨酸残基（C末端CAAX基序）可直接进行异戊二烯化修饰。一部分CAAX蛋白,其末端可以在牛龙酰基转移酶Ⅰ（GGTase-I）的作用下进行牛龙基化修饰,还有一部分CAAX蛋白,例如K-Ras,在法呢酰基转移酶（FTase）的作用下进行法尼基化修饰,其中的“X”残基表明这种CAAX蛋白是被法尼基化还是牛龙基化修饰:一般情况下,如果“X”是亮氨酸,这种蛋白就会被牛龙基化修饰,否则就会被法尼基化修饰。CAAX蛋白末端进行异戊二烯化修饰后可以增强其蛋白羧基端的疏水性,进而增强膜的亲和力及与配体的结合能力,从而增强其生物学活性。FTase和GGTase-I有一个相同的α亚单位,但是分别具有各自独特的表明其底物特异性的β亚单位。例如,GGTase-I是由Fnta编码的一个α亚单位和Pggtlb编码的独特的β亚单位组成。GGTase-I是许多真核细胞的必需酶,在果蝇和酵母菌种GGTase-I酶的β亚单位的无效突变通常是致死性的。GGTase-I缺乏导致生物死亡的主要原因是Rho1p和Cdc42p蛋白无法进行牛龙基化,而这种牛龙基化在特定条件下可通过FTase进行法尼基化弥补。RAS蛋白的法尼基化已引起学者的足够重视,研究表明,Ras蛋白的法尼基化对其靶向定位于细胞膜上的结合位点和保持正常的转化能力是非常必须的。在动物模型中,法呢酰基转移酶抑制剂（FTIs）具有高效的抗肿瘤活性且毒性低,而在临床试验中,FTIs的疗效并不理想,其可能原因是FTase缺乏时RAS蛋白进行了牛龙基化。许多研究已证实GGTIs能抑制多种K-ras突变肿瘤细胞株的增殖,同时研究还表明GGTIs能改善多发性硬化症动物模型的表型以及抑制肝癌中肝炎病毒的复制等。鉴于GGTase-I和FTase在K-ras突变诱导肿瘤发生中的作用以及前期研究结果,本研究旨在应用条件性敲基因技术建立动物模型,并运用组织病理学、分子生物学、免疫学等研究手段,充分阐明条件性敲除GGTase-I的β亚单位（Pggtlb）或FTase的β亚单位（Fntb）后,阻断CAAX蛋白异戊二烯化修饰,从而抑制K-ras基因突变诱导的肺癌发生的作用,为肺癌的基因治疗提供科学依据。目的（1）利用条件性基因敲除技术建立符合人类肺癌病变特征的动物模型;（2）应用组织病理学等方法观察肺癌组织病理形态,探讨Pggtlb或Fntb基因敲除对K-ras基因突变诱导肺癌形成的抑制作用;（3）探讨Pggtlb或Fntb基因敲除抑制K-ras基因突变诱导肺癌发生的分子生物学机制。方法1.条件性敲基因动物模型的建立及其基因型验证利用Cre/lox P系统条件性敲入K-ras基因,敲除GGTase-I或FTase基因,分别建立K-ras(KLSL)、GGTase-I(Pggtlbfl/fl)和FTase(Fntbfl/fl)条件性敲基因鼠模型。然后以KLSL鼠和Pggtlbfl/fl鼠或Fntbfl/fl鼠杂交产生KLSLPggtlbfl/fl鼠和KLSLFntbfl/fl鼠,经基因分型后筛选出符合要求的小鼠。应用PCR技术进行基因型验证。2.实验动物分组按基因型分为三组:即KLSL（A组）、KLSLPggtlbfl/fl（B组）和KLSLFntbfl/fl（C组）,各组根据感染病毒种类的不同又分为两个亚组即:cre腺病毒载体感染组（实验组:A1组、B1组和C1组）和β-gal腺病毒载体感染组（对照组:A2组、B2组和C2组）。3.干预方法第14天龄时应用雾化吸入法进行腺病毒载体干预,分别敲除或激活KLSL、KLSLPggtlbfl/fl和KLSLFntbfl/fl基因。4.称量体重病毒感染前及以后每周末称量所有实验鼠体重。5.各组动物生存率测定自基因干预起,观察各组动物的生存时间。6.病理学检查不同时间点处死动物,留取肺脏、肝脏、脾脏等组织器官并称量其重量,一部分组织进行苏木素-伊红（HE）染色,观察肿瘤细胞形态;另一部分留取标本进行分子生物学检测。7.免疫组织化学染色进行CD4、CC10、CD8、SP-C、非异戊烯化Rap1A及Ki-67的免疫组织化学染色。8.Real-time PCR检测肺脏、肝脏和脾脏等组织器官中Pggtlb、Fntb和KLSL等基因的mRNA表达水平。9.Western blot检测肺脏肿瘤组织中非异戊烯化RAP1A、总RAP1A、p-ERK1/2、p-AKT、总AKT、总ERK1/2等的蛋白表达水平。10.统计学分析连续性数据用（?）±SD表示,离散数据用例数和百分数表示。三组间生存率的比较应用Kaplan-Meier方法,其余指标应用单因素方差分析。应用SPSS统计软件进行统计学处理（version 11.0;SPSS Inc）,P＜0.05有统计学差异。结果1.实验动物基本情况腺病毒载体干预动物的共60只。最终完成基因干预的共58只,其中A1组10只,A2组9只,B1组10只,B2组9只,C1组10只,C2组10只。本文对完成实验的58只实验鼠的资料进行分析。2.各组动物的基因分型共有6个亚组,分别是A1组(KG12D组);B1组(KG12DPggtlb△/△组);C1组(KG12DFntb△/△组)和A2组(KLSL组);B2组(KLSLPggtlbfl/fl组):C2组(KLSLFntbfl/fl组)。3.基因敲除率测定为验证Cre介导的基因敲除效果,应用定量PCR分析了基因组DNA和cDNA。与脾脏比较,肺脏各基因的敲除率均显著增高（P均＜0.05）。4.各组实验动物体重的变化各组实验鼠的基础体重无显著性差异。A1组、B1组和C1组治疗后体重增加,但增加程度均显著低于对照组（P＜0.01）。在A1组体重增加缓慢,由基础状态的（9.16±0.42）增至3周末的（10.10±0.36）,B1组和C1组体重增加趋势相似,组间未见显著性差异（P＞0.05）。5.各组动物肺脏与体重比值（LW/BW）变化与A1组比较,B1组、C1组及对照组均显著降低（P均＜0.01）,在Cre感染后3周时,A1组肺体重显著增加,这可能与其肿瘤形成有关。6.各组实验动物脾脏与体重（SW/BW）比值变化3周末时,与对照组比较,A1组、B1组和C1组显著增高（P均＜0.01）;而A1组、B1组和C1组间无统计学意义。5周末时,与A1组比较,B1组、C1组及对照组均显著降低（P均＜0.01）。7.各组实验动物生存率分析对照组生存率显著高于实验组（P均＜0.01）;与A1组比较,B1和C1组生存率显著延长（P＜0.01）,而B1组和C1组间无统计学意义。A1组在Cre感染后10天内未见有肺癌相关的死亡,但其后生存状态迅速恶化,绝大部分在3周内死于呼吸困难。8.病理学检查3周时均可见非典型腺瘤性增生（AAH）、支气管上皮细胞增生（EH）和腺瘤三种病理改变,但A1组病变更为明显且出现弥漫性腺癌阻塞肺泡腔。5周时,可见弥漫性腺癌细胞堵塞了大部分肺泡腔。肿瘤细胞具有深染的、不规则的细胞核,核浆比例明显失调,癌细胞散在或融合成片,肿瘤细胞团直径显著增大,B1组和C1组病变程度较A1组明显减轻。正常的肺脏未见肿瘤组织,说明相关基因未被激活。9.免疫组织化学染色免疫组化染色显示在肺肿瘤组织中单核细胞/巨噬细胞标志CD11b、CD4/CD8染色均为阴性,细支气管细胞标志CC10染色部分为阴性,部分阳性;肺泡Ⅱ型细胞标记SP-C染色为阳性。与A1组比较,B1组和C1组SP-C和Ki-67染色明显减弱。10.Western blot检测B1组和C1组中可见非异戊烯化RAP1蛋白表达明显增高,对照组和A1组无表达;在B1组和C1组均可见P-AKT蛋白表达水平显著升高,A1组、B2组和C2组无明显变化;在实验组P-ERK1/2蛋白表达均降低,其中B1组降低最为显著。各组间总AKT和总ERK1/2蛋白表达水平无显著差异。结论（1）利用条件性敲基因技术定时、定点的敲入癌基因K-ras能建立符合人类肺癌病变特征的动物模型;（2）条件性敲除Pggtlb基因或Fntb基因能抑制K-ras突变诱导肺癌的发生和发展;（3）Pggtlb基因或Fntb基因敲除后抑制K-ras突变诱导肺癌发生和发展的分子机制是抑制Ras蛋白的转录后修饰,从而下调Ras蛋白依赖性激活的ERK的蛋白表达、抑制肿瘤细胞的增殖能力。第二部分体外部分背景基因突变是肿瘤发生、发展的重要原因,在多种肿瘤中均存在癌基因的突变。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）约占肺癌的70%,它是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,严重影响着人类健康。在NSCLC中,K-ras是最常见的癌基因之一,它可促进肺癌的发生、发展。因此,K-ras基因在诱发肺癌发生、发展中的作用日益引起学者的重视。研究表明,RAS蛋白属于具有CAAX基序的细胞内蛋白的一种,这类蛋白末端的半胱氨酸羧基可在牛龙酰基转移酶Ⅰ（GGTase-I）催化下进行牛龙基化修饰,亦可在法呢酰基转移酶（FTase）催化下进行法尼基化修饰,这两种转录后修饰被称之为异戊二烯化。GGTase-I和FTase具有共同的α亚单位,而其β亚单位的差异决定了其底物的特异性。在动物实验中,利用条件性基因敲除技术敲除GGTase-I或FTase基因后可抑制K-ras诱导肺癌的发生、发展,但敲除GGTase-I或FTase基因对鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblast,MEF）活力影响的文献尚未见报道。因此,为进一步探讨GGTase-I或FTase基因MEF的影响,本研究旨在应用条件性敲基因技术建立K-ras、GGTase-I和FTase基因的条件性敲除细胞模型,并运用分子生物学、免疫学等研究手段,阐明GGTase-I或FTase基因对K-ras突变细胞株的影响及其分子机制,为诊治K-ras基因诱导的肺癌提供科学依据。目的（1）利用条件性敲基因技术建立建立K-ras和GGTase-I或FTase基因的条件性敲基因MEF模型;（2）观察K-ras基因突变对各组细胞株生物特性的影响;（3）研究条件性敲除GGTase-I或FTase基因后对K-ras突变生物特性的影响;（4）探讨条件性敲除GGTase-I或FTase基因后抑制K-ras突变MEF生物特性的分子机制。方法1.MEF细胞株的获取以胎龄为12.5-17.5天的KLSL、KLSLPggtlbfl/fl和KLSLFntbfl/fl鼠为对象,取其胚胎,获取KLSLMEF、KLSLPggtlbfl/fl和KLSLFntbfl/flMEF。2.实验细胞分组:按基因型分为三组:即KLSL（A组）、KLSLPggtlbfl/fl（B组）和KLSLFntbfl/fl（C组）,各组根据感染病毒种类的不同又分为两个亚组即:Cre腺病毒载体感染组（实验组,A1组、B1组和C1组）和β-gal腺病毒载体感染组（对照组,A2组、B2组和C2组）。3.实验细胞腺病毒感染:应用cre和β-gal腺病毒载体分别感染各组细胞株。4.基因分型:利用PCR技术对各组细胞株进行基因分型。5.Real-time PCR:检测各组细胞株GGTase-I、FTase和KLSL的mRNA的表达水平。6.各组MEF生物特性检测:分别检测各组细胞株的生长情况、克隆形成能力、迁移能力和凋亡情况。7.统计学分析:连续性数据用（?）±SD表示,离散数据用例数和百分数表示。组间生长曲线比较应用单因素方差分析,其余指标应用T检验。应用SPSS统计软件进行统计学处理（version 11.0;SPSS Inc）,P＜0.05有统计学差异。结果1.MEF基因敲除率检测:实验组中均可见KLSL的活化及GGTase-I和FTase的敲除且其敲除率显著高于体内实验,而对照组中未见KLSL的活化及GGTase-I或FTase的敲除。2.各组MEF基因干预后基因型检测各组基因分型与体内部分相同。3.各组MEF生长能力测定在实验组中,与B1组、C1组比较,A1组生长显著增快,而B1组和C1组间无显著性差异。对照组中各亚组间无显著性差异。A1组和A2组、B1组和B2组、C1组和C2组间比较均有显著性差异。4.各组MEF迁移能力测定12h和24h时A1组与A2组、B1组与B2组和C1组与C2组之间均有显著性差异;A1组显著高于B1组和C1组,而对照组中各亚组间无显著性差异。5.各组MEF克隆形成检测只有A1组形成克隆,而B1组和C1组细胞未见克隆形成。对照组中亦未见克隆形成。6.各组MEF凋亡检测A1组MEF的凋亡率为3.31±1.34%,B1组为13.91%±1.88%,C1组为9.57%±2.45%。与A1组比较,B1组和C1组的细胞凋亡率显著增高,且B1组显著高于C1组,而对照组中各亚组间无显著性差异。7.Western blot与A2组比较,A1组Caspase-3的蛋白表达水平显著降低,在B组和C组中,与各自亚组比较,B1组和C1组Caspase-3的蛋白表达水平显著增高。磷酸化-P70蛋白表达水平在各组间无显著性差异。在B组和C组中,与各自亚组比较,B1组和C1组PARP的蛋白表达水平显著增高,而A1组与A2组间无显著性差异。结论（1）应用条件性敲基因技术可建立同时伴有K-ras活化和GGTase-I或FTase基因敲除的细胞株;（2）K-ras基因突变显著增强细胞的增殖能力、迁移能力和克隆形成能力并抑制其凋亡能力;（3）条件性敲除GGTase-I或FTase基因后可显著抑制细胞的增殖能力、迁移能力和克隆形成能力并增强其凋亡能力;（4）GGTase-I或FTase可作为治疗K-ras基因活化诱发的肺癌的靶基因;（5）敲除GGTase-I或FTase基因作用于K-ras突变MEF的主要机制是:抑制K-ras蛋白转录后修饰,增强凋亡基因表达,促进细胞凋亡。

论文目录

• 第一部分 体内实验
• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 第二部分 体外部分
• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 英文文章I
• 英文文章II