家兔子宫内膜及平滑肌细胞体外分离及扩增的研究

论文摘要

对子宫内膜腺上皮细胞、基质细胞及平滑肌细胞进行体外分离培养,可以为妊娠及子宫疾病等生理与病理方面的研究提供理想的模型。获得大量的、纯化的子宫细胞是上述研究的关键步骤之一,也是国内外学者关注的问题之一。为探讨一种能够获得大量的纯度高、活力强的子宫细胞的方法,本试验采用酶消化法、过滤法、离心法及差速贴壁纯化法相结合,获取家兔子宫内膜腺上皮细胞、基质细胞及子宫平滑肌细胞;用旋转式生物反应器和微载体对子宫内膜细胞进行大量扩增;于培养液中添加不同浓度的雌激素和孕激素及其组合对细胞进行培养;通过光镜观察、免疫细胞化学染色、免疫荧光染色对细胞进行鉴定,通过流式细胞仪检测细胞纯度;用噻唑蓝(MTT)法间接测定雌激素和孕激素对子宫内膜细胞和平滑肌细胞体外增殖的影响。获得以下结果:1.利用酶消化法、过滤法、离心法及差速贴壁法相结合,获得了高纯度的子宫内膜上皮细胞、基质细胞以及平滑肌细胞。免疫细胞化学染色和流式细胞仪分析表明,三种细胞的纯度分别达到96%,95%和98%以上。2.用旋转式生物反应器和微载体扩增细胞效率高,细胞增殖快,增殖速度大约为普通培养法的4倍,细胞特性跟普通培养法没有差别。3.雌激素(100nmol/L)和少量孕激素(10nmol/L)对上皮细胞增殖有明显的促进作用;孕激素(100nmol/L)对基质细胞的增殖有明显的促进作用;两种激素对平滑肌细胞的增殖也有一定促进的作用。完善了子宫内膜上皮细胞、基质细胞和平滑肌细胞的分离纯化方法,用旋转式生物反应器和微载体实现了对细胞的大量扩增,证明了雌激素和孕激素对体外培养的上述细胞有促进增殖的作用,为研究子宫疾病及胚胎植入奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 文献综述
• 第一章 家兔子宫内膜和平滑肌细胞体外分离及扩增的研究进展
• 1.1 子宫的结构
• 1.1.1 外膜
• 1.1.2 肌层
• 1.1.3 内膜
• 1.2 子宫的周期性变化及其内分泌调节
• 1.2.1 子宫内膜的周期性变化
• 1.2.2 子宫肌层的周期性变化
• 1.2.3 子宫内膜周期性变化的神经内分泌调节
• 1.3 雌激素和孕激素的来源及其作用
• 1.3.1 雌激素的来源
• 1.3.2 雌激素的作用
• 1.3.3 孕激素的来源
• 1.3.4 孕激素的作用
• 1.4 子宫内膜及平滑肌细胞体外培养的研究进展及其应用
• 1.4.1 子宫内膜及平滑肌细胞原代分离培养的方法
• 1.4.2 子宫内膜及平滑肌细胞体外扩增的方法
• 1.4.3 影响原代培养细胞的因素
• 1.4.4 子宫内膜及平滑肌细胞体外培养的生物学特性
• 1.4.5 细胞的生长和增殖过程
• 1.4.6 体外培养子宫内膜及平滑肌细胞的应用
• 1.5 雌激素和孕激素对子宫细胞增殖的影响及其作用机制
• 1.5.1 雌激素的作用机制
• 1.5.2 孕激素的作用机制
• 实验部分
• 第二章 家兔子宫内膜及平滑肌细胞的分离培养及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 试剂及仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 家兔子宫的采集
• 2.2.2 家兔子宫细胞的分离培养
• 2.2.3 细胞形态观察
• 2.2.4 细胞的免疫细胞化学鉴定
• 2.2.5 细胞纯度分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 细胞形态观察
• 2.3.2 细胞的免疫细胞化学鉴定
• 2.3.3 细胞的纯度
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 家兔子宫内膜细胞在旋转生物反应器中的扩增
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验动物
• 3.1.2 试剂及仪器
• 3.1.3 Cytodex-3 微载体预处理
• 3.1.4 生物反应器使用前的准备
• 3.2 方法
• 3.2.1 家兔子宫的采集
• 3.2.2 家兔子宫内膜细胞的分离培养及扩增
• 3.2.3 细胞形态学观察
• 3.2.4 细胞的免疫荧光鉴定
• 3.2.5 细胞生长曲线
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 细胞的形态特点及生物学特性
• 3.3.2 细胞的免疫荧光鉴定
• 3.3.3 细胞生长曲线
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 性腺激素对家兔子宫内膜及平滑肌细胞体外增殖的影响
• 4.1 材料
• 4.1.1 试验动物
• 4.1.2 试剂及仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 家兔子宫内膜及平滑肌细胞的分离培养
• 4.2.2 试验设计
• 4.2.3 培养细胞的形态观察
• 4.2.4 MTT 比色试验测细胞生长曲线
• 4.2.5 细胞免疫荧光鉴定
• 4.2.6 细胞活性检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 细胞的形态观察
• 4.3.2 不同水平性腺激素对细胞体外增殖的影响
• 4.3.3 细胞免疫荧光鉴定
• 4.3.4 细胞活性检测结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 致谢
• 作者简介