人工湿地植物根际微生物遗传多样性分析与功能鉴定

论文摘要

近20年来,人工湿地系统由于具有独特的净化机理和功能而越来越多地用于生活污水处理。人工湿地系统受到国际上广泛关注的主要原因是其具有低能耗,低建设与运行成本和操作、维护与管理简便等优点。本实验用样本采自中南林业科技大学株洲校区人工湿地中试基地,该基地始建于2002年,主要用于处理学生区生活污水与实验室混合废水。人工湿地中有着非常复杂的化学、物理和生物的反应和循环,这些反应是由湿地中的动植物和微生物共同参与完成的,而微生物是人工湿地系统去污的主要作用者。微生物种群结构的多样性、稳定性和种群恢复性在维护人工湿地系统处理效果与稳定性中起着关键作用,因此,分析人工湿地环境样品中的微生物群落结构,找出湿地系统中的优势菌,并了解其功能,有助于进一步揭示人工湿地去污的机理。本文以人工湿地处理池中的土壤为研究对象,利用选择性培养基法和PCR-DGGE技术研究人工湿地中的微生物多样性,从而获得微生物群落演变规律。实验结论以下：1.DGGE技术实验优化结论1.1 DNA提取方法的优化：运用改良的SDS法,提取的DNA完整性强,纯度高,不需要纯化就可以进行PCR扩增后续工作。再者,提取前无需特别处理,操作简单,提取时间短,是一种理想的适于土壤微生物DNA的提取方法。1.2 PCR-DGGE技术的优化：在用PCR-DGGE技术研究微生物遗传多样性时,用F357GC和R518引物,降火温度为55℃和35个循环时的产物最为理想。利用时间进程法确定了DGGE水平电泳的最佳时间为5h,电压为150V,在该条件下,对PCR特定片段的分离特性较好。1.3采用的PAGE银染法大大节约了试剂和材料,其方法耗时短、步骤简易,染出的胶背景低、分辨率高。采用改进的煮沸法从PAGE中回收差异条带,这种方法程序简化,并有利于减少二次扩增时模板信息量的损失。2.选择性培养基法和PCR-DGGE技术实验结论2.1选择性平板培养基法：有植物与无植物系统的微生物数量都随季节变化,在“秋-冬-春-夏”季节演替中,微生物数量呈现“高-低-高”和“高-低-高-低”两种季节性变化规律。相同季节的两个处理单元微生物的数量,大致都呈“低-高-低”的变化趋势。2.2 PCR-DGGE技术：夏季微生物种类明显多于其他季节,春秋两季的微生物种类基本差不多,冬季微生物种类最少；有植物单元微生物种类比无植物单元种类多。UPGMA聚类分析DGGE图谱后发现,同一季节土样的微生物聚集在同一个分支下则可归为一组。Shannon指数表明,两个处理单元（有植物和无植物）微生物多样性在相同季节情况下,沿水流方向呈先增后减的规律。2.3克隆测序结论：选取部分优势条带克隆测序,共得到5个不同的序列,经过NCBI同源性分析和检索,分别找到源性最近的已知类群,分别为肠杆菌属、弧菌、欧文氏菌、产酸克雷伯菌。BLASTX比较,发现这5个样分别与3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸、假设蛋白、低优质蛋白、保守假设蛋白最为相近。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 人工湿地的概况
• 1.1.1 人工湿地概念与应用领域
• 1.1.2 人工湿地的作用机理
• 1.1.3 人工湿地污水处理发展简史与应用现状
• 1.2 人工湿地中微生物的去污研究进展
• 1.2.1 微生物的去污机理研究
• 1.2.2 植物根际生境对微生物的影响
• 1.2.3 人工湿地系统中微生物的种群
• 1.3 微生物在污水处理中的应用现状
• 1.3.1 微生物处理污水的方法
• 1.3.2 现代生物工程污水处理法
• 1.4 DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用
• 1.4.1. DGGE技术的原理
• 1.4.2 DGGE技术的关键环节和优化
• 1.4.3 DGGE在环境治理中的应用
• 1.4.4 DGGE技术的展望
• 1.5 本研究目的和内容
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究内容
• 2 人工湿地中试研究基地概况
• 2.1 人工湿地结构
• 2.2 处理系统运行状况
• 2.3 三级叠流湿地的建设
• 2.3.1 叠流系统工艺流程说明
• 2.3.2 人工湿地植物种类配置与填料理化性能
• 3 人工湿地植物根际微生物的遗传多样性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 药品、试剂、仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 选择性平板培养基法
• 3.2.2 DGGE技术的结果与讨论
• 3.3 小结
• 4 人工湿地植物根际微生物种类的功能鉴定
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 药品与试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 二次PCR结果
• 4.2.2 蓝白斑筛选结果
• 4.2.3 菌落PCR
• 4.2.4 测序结果分析序列分析和相似性比较
• 4.3 小结
• 5 总结
• 5.1 结论
• 5.2 创新点和今后研究建议
• 5.2.1 创新点
• 5.2.2 研究展望
• 参考文献
• 在学期间的主要研究成果
• 致谢