PARP抑制剂在阿霉素诱导的多发性骨髓瘤细胞自噬发生中的功能研究

论文摘要

研究背景和目的:自噬（autophagy）是蛋白降解的一种动态过程,在营养匮乏时可有典型出现。自噬作为一种溶酶体依赖的降解路径,经常在放疗或化疗的肿瘤细胞中发生,但其在肿瘤细胞中是保护细胞还是促进细胞死亡尚存争议。大量研究表明,药理或遗传机制上抑制自噬,不同类型细胞可产生不同结果。多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）的高蛋白合成与分泌活性使其与蛋白降解的主要方式—自噬（autophagy）,有着千丝万缕的联系。本实验室研究已证实阿霉素在骨髓瘤细胞中产生的自噬对骨髓瘤细胞具有保护作用。聚（ADP-核糖）聚合酶[ poly （ADP-ribose）polymerase, PARP]是蛋白质翻译后的修饰酶,在DNA损伤断裂时,其聚ADP核糖基化作用可催化尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide-adenine dinucleotide, NAD+）裂解为二磷酸腺苷核糖（ADP-ribose）和尼克酰胺,并将二磷酸腺苷核糖转移至受体蛋白谷氨酸残基上形成聚二磷酸腺苷核糖聚合物[poly（ADP ribose）, PAR]。PAR也能通过电荷排斥作用,防止附近的DNA分子与受损的DNA进行重组,并能引导DNA修复酶与缺口接触,进行修复。每合成1 mol PAR,需要消耗1mol NAD+和4当量ATP,因此,当PARP的反复活化过度时,将会引起细胞内NAD+和ATP的水平下降。PARP被证实参与不同的细胞死亡路径,抑制它可在肿瘤细胞中产生不同效应。那么抑制PARP对阿霉素（doxorubicin,DOXO）诱导的骨髓瘤细胞自噬及其死亡会有什么样的作用呢?它们之间又有什么具体的联系呢?本课题以多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）细胞系NCI-H929（H929）为实验对象,探讨PARP抑制剂ANI（4-amino-1,8-naphthalimide）对阿霉素诱导的多发性骨髓瘤细胞自噬的作用及其可能的分子机制,从而进一步为多发性骨髓瘤的新治疗方法提供思路。方法和结果:1、阿霉素（doxorubicin）引起MM细胞凋亡:MTT实验显示,分别采用0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5 umol /l阿霉素处理H929细胞24 h,各处理组活细胞百分比下降且呈浓度依赖性,提示阿霉素（doxorubicin）能够有效诱导多发性骨髓瘤MM细胞死亡。台盼蓝排斥试验显示,以此H929细胞IC50值（2.2 umol/l）处理细胞24 h,相对未处理组活细胞百分比为85.5%。Caspase抑制剂zVAD.fmk（10 umol/l预孵育2 h,MM细胞非抑制浓度）可显著抑制阿霉素诱导的H929细胞死亡（P<0.05）;2、聚ADP核糖基化作用被激活:①DOXO 2.2 umol/l分别孵育H929细胞0, 0.5, 1, 2, 5 h, western blot显示:细胞内PAR呈时间依赖性上升,2 h达到高峰,5 h显示为下降;②2.2 umol/l阿霉素处理H929细胞不同时间（0, 15, 30, 45, 60 min）,细胞内ATP相对未处理组分别百分比为95±0.35%, 57±0.56%, 56±0.16%, 51±1.2%,均显著低未处理组（P<0.05）;3、阿霉素作用骨髓瘤细胞诱导自噬,ATP上升保护细胞:①DOXO 2.2 umol/l处理H929细胞0, 1, 6, 12, 24 h, western blot检测靶细胞中自噬相关蛋白LC3-II的表达呈时间依赖性显著增加;②2.2 umol/l阿霉素处理H929细胞24 h,检测细胞内ATP水平,相对未处理组百分比为233%;3MA 10mM抑制自噬,ATP水平下降,细胞死亡率增加;4、ANI,寡霉素（Oligomycin）,丙酮酸甲酯（methyl pyruvate,MP）分别与阿霉素联用,对骨髓瘤细胞自噬、ATP及存活率的影响:AN（I10umol/l预孵育1 h）联合DOXO,Oligomycin 1umol/l预孵育1 h联合用药,MP 1mmol/l预孵育8 h联合DOXO处理H929。①MTT显示: ANI联合DOXO对H929细胞可产生增敏作用,与DOXO单药作用相比差异显著（P<0.05）;Oligomycin 1umol/l预孵育1 h联合用药,促进细胞对阿霉素的敏感性（P<0.05）。台盼蓝排斥实验:MP联合用药较DOXO单处理组,活细胞百分比上升,差异显著（P<0.05）;②ATP生物发光检测证实:PARP抑制剂ANI、能量抑制剂Oligomycin、自噬抑制剂3MA、caspase抑制剂zVAD.fmk可显著降低阿霉素诱导的细胞内ATP水平（P<0.05）;MP联用阿霉素与单用阿霉素组相比,细胞内ATP水平无显著差异（P>0.05）;③Western blot显示PARP抑制剂ANI联合阿霉素处理NCI-H929细胞,靶细胞中自噬相关蛋白LC3-II的表达下降;能量抑制剂Oligomycin也抑制自噬;MP则促进LC3-II的表达。结论:1、阿霉素能够呈剂量依赖性诱导MM细胞死亡,凋亡为其主要通路;2、阿霉素诱导细胞损伤可激活PARP酶的作用,聚ADP核糖基化作用被激活;3、阿霉素诱导多发性骨髓瘤细胞产生自噬,进而高表达ATP,以保护细胞;4、PARP抑制剂ANI的非抑制浓度联合阿霉素,可抑制自噬,增加骨髓瘤细胞对阿霉素的敏感性。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 1. 阿霉素
• 2. 聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）
• 3. 自噬
• 1. 实验材料和仪器
• 1.1 细胞系与培养
• 1.2 试验试剂
• 1.3 试剂配置
• 1.4 主要使用的仪器
• 2. 试验方法
• 2.1 MTT 法检测各药物对MM 细胞的细胞毒作用
• 2.2 台盼蓝排斥试验检测活细胞率%
• 2.3 ATP 生物发光法测细胞内相对ATP 水平
• 2.4 Western blot 检测相关蛋白表达
• 2.5 统计学处理
• 3. 结果
• 3.1 阿霉素（doxorubicin）诱导骨髓瘤细胞凋亡及PARP 活化
• 3.2 ANI, Oligomycin, MP（methyl pyruvate）分别与阿霉素联用，对骨髓瘤细胞自噬、ATP 及存活率的影响
• 4. 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢