林蛙油小分子肽的制备及其分子量分布研究

论文摘要

本研究以林蛙油为底物,选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶和复合蛋白酶分别进行酶解实验,并通过测定每种酶的酶活力,酶解后底物的水解度（DH）以及酶解液中多肽含量（TCA-SN）和游离氨基氮的含量来判定各种酶的酶解效果。结果表明木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活力高于其他蛋白酶,分别为510U/mg和350U/mg;水解度较高,分别为12.3%和11.8%;酸溶性多肽的得率相对较高,分别为43.7%和50.3%;并且水解产物中游离氨基氮的含量较低,分别为0.42mg/mL和0.56mg/mL;综合考虑,本研究选用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解林蛙油制备活性肽。采用双酶结合可控酶解技术对林蛙油进行水解。首先采用木瓜蛋白酶对底物进行水解,利用单因素试验考察了底物浓度、加酶量、水解温度、pH值和酶解时间对底物的水解度及产物中酸溶性多肽含量的影响,并筛选出对其影响显著的因素进行Box-Behnken中心组合设计和响应面分析,对酶解反应的主要影响因素进行多项式回归模型建立和最优化,确定了木瓜蛋白酶酶解底物的最佳工艺条件为:温度60℃,pH值6.5,底物浓度1%,酶用量（E/S）为1.5%,酶水解时间3.0h。在此酶酶解的基础上,进一步采用碱性蛋白酶进行水解,同样在单因素实验的基础上,运用Box-Behnken中心组合设计和响应面分析,确定了碱性蛋白酶酶解的最佳工艺条件为:加酶量（E/S）为0.875%,温度50℃,pH值为8.0,水解时间3.0h。底物水解度和酸溶性多肽的含量分别达到18.4%和78.6%,比单酶酶解分别提高了5.6%和30.2%。酶解物经Sephadex G-15凝胶柱分离,木瓜蛋白酶酶解物中多肽分子量在300-1355Da之间的占总洗脱峰面积的41.3%;大于1355Da的占38%;小于300Da的占20.7%。碱性蛋白酶酶解物中多肽分子量在300-1355Da之间的占总洗脱峰面积的38.2%;大于1355Da的占42.6%;小于300Da的占19.2%。双酶结合酶解物中多肽分子量在300-1355Da之间的占总洗脱峰面积的52.6%;大于1355Da的占31.5%;小于300Da的占15.9%。将分布在300-1355Da之间的物质,利用高效液相色谱分析,在峰图上出现三个高低不同的色谱峰,保留时间依次为21.837min、23.300min和24.499min,其中保留时间在23.300min时对应的物质含量最大。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪分析,水解液中含有四种不同分子量的肽类物质,其分子量分别为:712.4Da、826.6Da、1101.2Da和1326.1Da。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 林蛙油
• 1.1.1 林蛙油的化学成分
• 1.1.2 林蛙油的研究现状
• 1.1.3 中国林蛙油产品的开发
• 1.2 生物活性肽
• 1.2.1 内源性生物活性肽
• 1.2.2 外源性生物活性肽
• 1.3 蛋白质酶解机理和活性肽的制备方法
• 1.3.1 蛋白质酶解机理
• 1.3.2 活性肽的制备
• 1.4 外源活性肽的消化吸收机制
• 1.4.1 小肽的吸收机制及其特点
• 1.4.2 小肽的释放及其影响因素
• 1.5 肽的生产理论基础和前景
• 1.6 本论文研究的主要内容和意义
• 1.6.1 主要研究内容
• 1.6.2 本论文研究的意义
• 第二章 酶解林蛙油蛋白酶的选择
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 酶活力的测定
• 2.2.2 林蛙油水相体系酶解反应的研究
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 酶解林蛙油制备小分子肽的工艺研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 不同因素对木瓜蛋白酶酶解反应的影响
• 3.2.2 Box-Behnken中心设计及其响应面法优化木瓜蛋白酶酶解工艺
• 3.2.3 不同因素对双酶酶解反应的影响
• 3.2.4 Box-Behnken中心设计及其响应面法优化双酶酶解工艺
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 3.4.1 木瓜蛋白酶酶解林蛙油的工艺条件
• 3.4.2 双酶结合酶解林蛙油的工艺条件
• 第四章 林蛙油小分子肽分子量分布研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料及设备
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 林蛙油小分子肽分子量的分布
• 4.2.2 林蛙油小分子肽的分子量
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 4.4.1 林蛙油小分子肽分子量的分布
• 4.4.2 林蛙油小分子肽的分子量
• 第五章 结论
• 5.1 蛋白酶的选择
• 5.2 林蛙油小分子肽制备工艺的优化
• 5.3 林蛙油小分子肽分子量的分布
• 5.4 林蛙油小分子肽的分子量
• 5.5 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介