用Genome shuffling筛选利用木糖葡萄糖高产乙醇的酿酒酵母

论文摘要

将可再生的木质纤维素原料转化为燃料乙醇是当前的研究热点,其中木糖的乙醇发酵是该转化技术工业化的基础及制约因素,但传统用于乙醇生产的酿酒酵母只能利用木质纤维素水解液中的葡萄糖产生乙醇,却不能利用木糖,因此要实现酿酒酵母对木糖的有效利用并产生乙醇,需在酿酒酵母中重组表达与木糖代谢相关的基因。本文采用一种新型的基因组改组（Genome shuffling）技术将木糖代谢的3个关键酶基因（木糖还原酶基因xy/1,木糖醇脱氢酶基因xyl2及木酮糖激酶基因xks1）导入酿酒酵母,使工程菌株能够利用木糖葡萄糖共发酵产生乙醇。在确定了原始菌株酿酒酵母（Saccharomyces cerevsiae）W5的原生质体制备及再生的最佳条件的基础上,以本实验室前期得到的3个重组酿酒酵母YX-3（含有xyl1）、LX-4（含有xyl2）及CXS-5（含有xksl）作为出发菌株,根据原生质体的损伤互补原则,摸索了各原生质体的最佳灭活条件,并采用正交试验优化了融合条件,通过TTC初筛,发酵复筛,经过3轮的基因组改组,最后选育出1株遗传稳定的能利用木糖葡萄糖高产乙醇的重组子GS3-10。在初始糖量为60g/L（葡萄糖40.75g/L,木糖20.34g/L）的条件下发酵120h后,其木糖及葡萄糖的利用率分别为70.12%及100%,能够产生18.98g/L的乙醇,比原始菌株酿酒酵母W5（14.15g/L）提高了 34.13%,其乙醇得率为0.350g/g（产生的乙醇/消耗的总糖）,比 W5（0.311g/g）增加了 12.54%。对重组子的基因组进行PCR验证,证明了xyl1及xyl2基因已稳定的整合于酿酒酵母的染色体上;重组子中3种酶活的测定结果也表明,木糖还原酶、木糖醇脱氢酶及木酮糖激酶的酶活力比W5分别提高了 28.33%、94.08%及51.68%,说明了该3种基因在酿酒酵母中得到了有效表达,Genome shuffling获得了成功。对重组子的摇瓶发酵条件包括混合糖的比例、摇床的转速以及摇瓶的装液量及其发酵罐性能进行了初步的摸索,结果发现严格而又精确的供氧水平对于重组子利用木糖葡萄糖发酵产生乙醇有着重要的影响。总之,本研究首次将Genome shuffling这种新型的技术用于疏通酿酒酵母的木糖代谢途径,这对于酿酒酵母将木质纤维素原料转化为生物乙醇的研究具有重要的意义。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 燃料乙醇的研究背景及意义
• 1.2 木质纤维素生产燃料乙醇
• 1.2.1 木质纤维素的组成
• 1.2.2 木质纤维素的水解
• 1.3 自然界中能利用木糖的微生物
• 1.3.1 木糖代谢途径
• 1.3.2 能利用木糖的微生物
• 1.3.3 理想的利用木质纤维素的微生物
• 1.4 原生质体融合技术构建发酵木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌
• 1.5 Genome shuffling在酿酒酵母中的应用
• 1.5.1 Genome shuffling的原理及技术方法
• 1.5.2 Genome shuffling的特点
• 1.5.3 Genome shuffling育种优势的实例验证
• 1.5.4 Genome shuffling用于酿酒酵母中乙醇含量的提高
• 1.5.5 Genome shuffling用于酿酒酵母中提高对周围环境耐受性的增强
• 1.5.6 Genome shuffling的难点及展望
• 1.6 本论文的研究目的及意义
• 1.7 本课题基金项目
• 1.8 本课题的主要研究路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 PCR扩增引物
• 2.1.3 主要培养基
• 2.1.4 主要药品及试剂配制方法
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 原始菌株的活化及保藏
• 2.2.2 原始菌株生长曲线的测定
• 2.2.3 原生质体制备及再生
• 2.2.4 原生质体灭活
• 2.2.5 原生质体融合
• 2.2.6 Genome shuffling
• 2.2.7 非Genome shuffling对照试验
• 2.2.8 重组子的筛选
• 2.2.9 重组子的鉴定
• 2.2.10 重组子的遗传稳定性
• 2.2.11 重组子摇瓶发酵性能的研究
• 2.2.12 重组子发酵罐发酵性能的研究
• 2.2.13 数据处理
• 第3章 结果与分析
• 3.1 W5原生质体制备及再生结果
• 3.1.1 菌龄对原生质体制备率及再生率的影响
• 3.1.2 脱壁预处理时间对原生质体制备率与再生率的影响
• 3.1.3 蜗牛酶浓度及酶解时间对原生质体制备率及再生率的影响
• 3.1.4 酶解时温育方式对原生质体制备率及再生率的影响
• 3.1.5 酶解温度对原生质体制备率及再生率的影响
• 3.1.6 酶解pH对原生质体制备率及再生率的影响
• 3.1.7 渗透压稳定剂的种类对原生质体再生率的影响
• 3.2 原生质体灭活
• 3.2.1 YX-3原生质体热灭活
• 3.2.2 LX-4原生质体紫外线灭活
• 3.2.3 CXS-5原生质体紫外线+LiCl灭活
• 3.3 原生质体融合
• 3.3.1 融合条件的正交试验
• 3.3.2 融合条件的验证试验
• 3.4 Genome shuffling
• 3.4.1 出发菌株的获得
• 3.4.2 重组子的筛选
• 3.4.3 重组子的鉴定
• 3.5 非Genome shuffling对照试验
• 3.6 重组子的遗传稳定性试验
• 3.7 重组子摇瓶发酵性能的研究
• 3.7.1 混合糖比例对重组子发酵的影响
• 3.7.2 转速对重组子发酵的影响
• 3.7.3 装液量对重组子发酵的影响
• 3.8 重组子发酵罐性能的研究
• 第4章 讨论
• 4.1 影响原生质体制备及再生的因素
• 4.2 原生质体灭活方法的选择
• 4.3 酶活的测定
• 4.4 摇瓶内溶氧水平对重组子发酵的影响
• 4.5 影响重组子在发酵罐中发酵的因素
• 4.6 重组酵母菌株的木糖代谢性能评价与分析
• 4.7 后续工作设想
• 第5章 结论
• 本文创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的文章