高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌的选育

论文摘要

本文以一株实验室保存的枯草芽孢杆菌YD-1为出发菌株。该菌株的较适碳源为葡萄糖,较适氮源为玉米浆和酵母粉,发酵过程中需要添加的金属离子为Mn2+,在培养基初始pH7.2,37℃,35mL装液量、10h种子、接种量5.7%、180r/min条件下摇床发酵3天,3-羟基丁酮产量最高可达15.60g/L。以YD-1为出发菌株,用紫外线进行诱变,经过初筛和复筛其产量从15.60g/L提高到17.78g/L,之后以硫酸二乙酯诱变,经初筛和复筛获得目的菌株S-10,产量19.02g/L,较出发菌株提高21.92%。对诱变菌株S-10进行遗传稳定性实验,将S-10在斜面上连续传代20次,分别取第1、5、10、15、20代进行发酵,测定其3-羟基丁酮产量,结果证明该菌株遗传稳定性良好,具备作为生产菌株的潜力。对菌株S-10的生理生化特征进行初步研究。与出发菌株YD-1相比,诱变菌株S-10死灭温度提高1℃,发酵液的颜色发生一定变化,培养14h的诱变菌株在显微镜下观察时发现更容易串联生长,其他生理生化指标无明显变化。实验确定发酵液的最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为酵母粉与玉米浆的混合物。研究了二价金属离子Mg2+、Zn2+、Mn2+与三价金属离子Fe3+对发酵产物的作用,四种离子均有促进作用,其中,Mn2+促进作用最为明显,其他离子作用相对较小。优化后,3-羟基丁酮产量提高到19.88g/L。优化S-10的发酵条件,其最佳发酵条件为pH7.0,温度36℃,装液量30mL,接种种子为8h种子,接种量5%,摇床转速180r/min,发酵时间84h。优化后,产量高达20.50g/L。对两株枯草芽孢杆菌进行SDS-PAGE凝胶电泳,发现二者在蛋白质水平上无明显差异。进一步采用RAPD技术,对枯草芽孢杆菌YD-1和诱变菌株S-10进行DNA水平上的遗传物质分析,发现二者电泳图谱存在差异,由此判断突变株在DNA水平上发生了轻微改变,是一株高产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌新菌株。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第1章 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 出发菌株
• 1.1.2 实验试剂及所配溶液
• 1.1.2.1 试剂
• 1.1.2.2 溶液
• 1.1.2.3 随机引物
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要实验仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 生长曲线的绘制
• 1.2.2 菌悬液的制备
• 1.2.3 紫外诱变致死曲线的绘制
• 1.2.4 硫酸二乙酯诱变
• 1.2.5 3-羟基丁酮标准曲线的绘制
• 1.2.6 原糖的测定（DNS法）
• 1.2.7 枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取
• 1.2.8 3-羟基丁酮产率
• 1.2.9 琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.2.11 RAPD
• 1.2.12 3-羟基丁酮的测定
• 1.2.13 枯草芽孢杆菌全蛋白分析
• 1.2.14 遗传稳定性实验
• 1.2.15 死灭温度测定
• 第2章 结果与讨论
• 2.1 出发菌株
• 2.2 3-羟基丁酮标准曲线
• 2.3 枯草芽孢杆菌生长曲线
• 2.4 紫外诱变
• 2.5 硫酸二乙酯诱变
• 2.6 3-羟基丁酮高产突变株选育谱系
• 2.7 遗传稳定性实验
• 2.8 菌株特性比较
• 2.8.1 死灭温度
• 2.8.2 对糖的利用情况
• 2.8.3 耐盐情况
• 2.8.4 发酵液颜色
• 2.8.5 微观察
• 2.9 培养基优化实验
• 2.9.1 碳源
• 2.9.2 氮源
• 2.9.3 生长因子
• 2.10 发酵条件优化
• 2.10.1 温度
• 2.10.2 pH
• 2.10.3 装液量
• 2.10.4 摇床转速
• 2.10.5 发酵时间
• 2.10.6 种龄
• 2.10.7 接种量
• 2.11 枯草芽孢杆菌全蛋白分析
• 2.12 全基因组的提取
• 2.13 RAPD实验
• 第3章 结论与展望
• 3.1 结论
• 3.2 展望
• 参考文献
• 综述
• 综述参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢