GST pi介导CML细胞的IFN-α抗性研究

论文摘要

慢性髓细胞性白血病（chronic myelognous leukemia，CML）是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，干扰素-α（IFN-α）是治疗CML的最有效制剂之一，但是干扰素耐药比率也很高。本实验室运用蛋白质学方法分别比较分析发现IFN-α耐药株KT-1／A3R细胞高表达GST pi蛋白，然而IFN-α敏感株KT-1／A3细胞几乎不表达此蛋白，运用半定量RT-PCR和Western blotting也同样证明上述结论。先前研究还证明IFN-α诱导A3细胞的细胞凋亡增加显著，bcr／ab1融合基因相应表达下调；而抗性株细胞凋亡不明显，bcr／ab1融合基因表达下调也不明显。以上研究表明GSTP1基因可能在A3R细胞对IFN-α的耐受机制中发挥着重要的作用。本实验旨在通过应用RNAi，抑制A3R细胞中GSTP1基因的表达，从而增强IFN-α通过bcr／ab1融合基因的作用而诱导的KT-1／A3R细胞凋亡，部分逆转A3R细胞对IFN-α的耐药性。目的初步探讨GSTP1在肿瘤细胞增殖及抵抗细胞凋亡中的作用，为研究IFN-α对CML的耐药机制提供新的思路。方法1．选择目标序列，设计并合成针对GSTP1基因siRNA模板，构建siRNA表达载体pSilencer-GSTP1-A和pSilencer-GSTP1-B；2．转染针对GSTP1基因的两对干扰质粒，采用半定量RT-PCR和Western blotting实验验证干扰的效果；3．A3R细胞经转染干扰质粒pSilencer-GSTP1-A及在IFN-α诱导下，流式细胞术检测48 h及72 h细胞凋亡率，用台盼蓝拒染法计24 h～96 h细胞数，MTT法测定24h～96 h细胞吸光度值，半定量RT-PCR测定48 h bcr／ab1 mRNA表达变化，同时设置未转染组及转染空白质粒组与之相比较，并且统计学分析以上结果。结果1．质粒与脂质体1∶4（质量／体积）比例混合转染48 h，发现经pSilencer-GSTP1-A干扰后A3R细胞中GSTP1基因表达下降约78％，蛋白表达下降约71％，经pSilencer-GSTP1-B干扰后A3R细胞GSTP1基因表达下降约53％，蛋白表达下降约50％；2．经pSilencer-GSTP1-A干扰后，与转染空白质粒组相比较，A3R细胞凋亡率48 h增加约4.53％，72 h增加约5.71％；台盼蓝拒染法：A3R细胞生长抑制率24 h～96 h分别约为4.56％、5.94％、5.83％、5.16％：MTT法：A3R细胞生长抑制率24 h～96 h分别约为4.48％、5.48％、6.06％、4.62％；RT-PCR测定48 h bcr／ab1基因表达下调约26％。结论1．成功构建了两干扰质粒pSilencer-GSTP1-A和pSilencer-GSTP1-B，而且质粒干扰效果前者强于后者；2．A3R细胞经质粒pSilencer-GSTP1-A干扰后能显著增强IFN-α诱导的细胞凋亡（P＜0.05），但只能轻度抑制细胞生长（P＞0.05）；3．GSTP1基因的表达下调，可能促进IFN-α诱导的bcr／ab1基因表达下调，而且通过这一机制也可能会最终导致细胞凋亡的增加。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要英文缩写注解
• 一 前言
• 1.1 慢性髓系白血病的概述
• 1.2 干扰素治疗慢性髓系白血病
• 1.3 GSTP1与肿瘤耐药及细胞凋亡的关系
• 1.4 新兴 RNA干扰技术的作用机制及其运用
• 1.5 选题思路
• 1.6 技术路线
• 二 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株和菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 引物合成
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 构建 siRNA表达载体
• 2.2.2 细胞转染及干扰效果的测定
• 2.2.3 分子生物学特征的检测
• 2.2.4 RT-PCR测定bcr/abl mRNA表达变化
• 2.2.5 统计学分析
• 三 结果
• 3.1 退火寡核苷酸与单链寡核苷酸电泳结果
• 3.2 重组质粒酶切结果
• 3.3 重组质粒的测序结果
• 3.4 siRNA干扰效果的测定
• 3.4.1 细胞总 RNA的提取结果
• 3.4.2 RT-PCR测定 GSTP1 mRNA表达变化结果
• 3.4.3 Western-blot测定 GST pi蛋白表达变化结果
• 3.5 流式细胞术检测细胞凋亡结果
• 3.6 细胞增殖检测
• 3.6.1 台盼蓝拒染实验
• 3.6.2 MTT法结果
• 3.7 RT-PCR测定bcr/abl mRNA表达变化结果
• 四 讨论
• 4.1 siRNA靶序列的选择
• 4.2 细胞的转染
• 4.3 GSTP1基因与细胞凋亡
• 4.4 GSTP1基因与细胞耐药
• 五 结论
• 六 进一步研究设想
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 研究生期间成绩