βγ-晶状体蛋白与三叶因子复合物生物化学特性与作用机制研究

论文摘要

βγ-CAT是一个从中国特有的两栖动物大蹼铃蟾（Bombina maxima）皮肤分泌物中分离得到的,由非晶状体βγ-晶状体蛋白（α-亚基, CAT-α）和三叶因子蛋白（β-亚基, CAT-β）天然结合在一起形成的复合物,α-亚基与β-亚基通过非共价的方式交联形成αβ2,分子量为72-kDa。CAT-α的N-末端部分（CAT-αN, 1-170氨基酸残基）是两个βγ-晶状体结构域,C-末端部分（CAT-αC）与产气荚膜梭菌ε毒素的膜插入结构域有序列同源性。为了分析βγ-CAT的βγ-晶状体蛋白结构域的生物化学特性,我们在大肠杆菌中分别表达了CAT-αN, CAT-αC和CAT-β。对天然纯化的βγ-CAT的免疫共沉淀实验表明CAT-α与CAT-β形成了一个紧密的复合物。Pull-down实验进一步证明重组表达的CAT-β能结合在重组表达的CAT-αN上。此外,我们还发现CAT-αΝ具有钙离子结合模体,存在于其β-折叠构象上。重组的CAT-αΝ可以结合钙离子探针铽离子,而且CAT-αΝ在结合钙离子后构象没有发生明显的改变。近年来,研究发现血小板也会发生凋亡,并且这个凋亡过程可能在血小板清除中起作用。βγ-CAT在哺乳动物中体内会引起很多毒理学作用,通过血液学分析发现βγ-CAT会引起兔子体内血小板数量发生显著的下降。因此,为了研究βγ-CAT对血小板的作用,我们将洗涤后的人血小板与不同浓度的βγ-CAT孵育30分钟,我们发现βγ-CAT使人血小板表现出了多种凋亡特征,如caspase-3的激活,磷脂酰丝氨酸外翻,线粒体膜电位去极化,细胞色素c的释放以及促凋亡蛋白Bax和Bak的表达上调。同时,通过血小板激活检测实验,如P-选择素在人血小板表面的表达,GPIIb/Ⅲa的激活和血小板聚集等,发现βγ-CAT在引起人血小板凋亡的同时并不引起血小板的激活。前期的研究表明,βγ-CAT可以在人红细胞上形成寡聚体并具有很强的溶血活性。我们通过实验进一步发现βγ-CAT （1 nM）可以引起红细胞内钙离子浓度急剧升高从而引起溶血。然而,在没有细胞外钙离子存在的情况下（反应体系中加入20 mM EGTA）,虽然βγ-CAT引起的溶血得到显著抑制,但是βγ-CAT仍然可以结合在红细胞膜上并寡聚化。另外,我们发现βγ-CAT在人血小板上引起的磷脂酰丝氨酸外翻和线粒体膜电位的下降也是钙离子依赖的。综上所述,我们的数据表明CAT-β（三叶因子蛋白）和CAT-αN（βγ-晶状体结构域）在体外可以相互结合,这为βγ-晶状体蛋白与三叶因子的蛋白在体外形成复合物形成了结构基础。此外,CAT-αN具有钙离子结合活性,而且βγ-CAT引起的溶血和血小板凋亡都是钙离子依赖的,这为进一步研究βγ-CAT生物学活性的作用机制提供了一个新的线索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 βγ-晶状体蛋白超家族的研究现状
• 1.1.1 前言
• 1.1.2 βγ-晶状体结构域
• 1.1.3 晶状体蛋白的进化
• 1.1.4 βγ-晶状体蛋白家族成员的序列差异和拓扑学结构
• 1.1.5 βγ-晶状体蛋白的钙结合特性
• 1.1.6 βγ-晶状体蛋白的功能
• 1.1.7 βγ-晶状体蛋白的功能与钙离子的关系
• 1.2 三叶因子的研究进展
• 1.2.1 引言
• 1.2.2 三叶因子家族及三叶结构域
• 1.2.3 三叶因子的表达和功能
• 1.2.4 三叶因子的作用机制
• 1.2.5 Bm-TFF2
• 1.2.6 存在的问题
• 1.3 βγ-CAT 的研究进展
• 1.3.1 引言
• 1.3.2 βγ-CAT 的发现
• 1.3.3 βγ-CAT 的生物学活性
• 1.3.4 研究βγ-CAT 的意义
• 1.4 血小板凋亡
• 1.4.1 前言
• 1.4.2 血小板的功能
• 1.4.3 细胞凋亡
• 1.4.4 血小板凋亡的发现及其特征
• 1.4.5 血小板凋亡与血小板激活的区别
• 1.4.6 血小板凋亡途径
• 1.4.7 问题和展望
• 参考文献
• 第二章 βγ-CAT 的βγ-晶状体结构域的生化特征研究
• 2.1.前言
• 2.2.材料与方法
• 2.2.1 实验材料与试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 蛋白表达
• 2.3.2 CAT-αΝ与 CAT-β相结合
• 2.3.3 CAT-αΝ的结构分析
• 2.3.4 CAT-αΝ的钙结合特性分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 βγ-CAT 诱导人血小板凋亡
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 βγ-CAT 引起血小板中caspase-3 的激活
• 3.3.2 βγ-CAT 引起血小板磷脂酰丝氨酸的外翻
• 3.3.3 βγ-CAT 引起血小板中线粒体相关的凋亡事件
• 3.3.4 βγ-CAT 不引起血小板的激活
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 参考文献
• 第四章 βγ-CAT 引起的红细胞溶血和血小板凋亡是外钙内流依赖的
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料和方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 βγ-CAT 引起的人红细胞溶血是钙离子依赖的
• 4.3.2 βγ-CAT 在人红细胞上引起外钙内流
• 4.3.3 βγ-CAT 与人红细胞膜的结合
• 4.3.4 βγ-CAT 引起人血小板细胞内钙离子浓度[Ca2+]i增加
• 4.3.5 βγ-CAT 引起的人血小板磷脂酰丝氨酸外翻和线粒体膜电位的去极化都是钙依赖的
• 4.4 讨论
• 参考文献
• 第五章 βγ-CAT 对人真皮成纤维细胞生物学活性及其机理研究
• 5.1 前言
• 5.2 人真皮成纤维细胞培养
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.3 结果与讨论
• 5.3 βγ-CAT 诱导人成纤维细胞坏死活性研究
• 5.3.1 实验材料
• 5.3.2 实验方法
• 5.3.3 结果与讨论
• 5.4 βγ-CAT 诱导人成纤维细胞坏死活性机制初探
• 5.4.1 材料与方法
• 5.4.2 实验方法
• 5.4.3 结果与讨论
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果