利用RNAi技术进行中国野生葡萄SBP转录因子功能研究

论文摘要

葡萄白粉病（Uncinula necator）是严重危害欧洲葡萄的真菌病害之一。本课题组采用mRNA差异显示和RACE技术（mRNA differential display reverse transcription-PCR, DDRT-PCR）获得了中国野生葡萄华东葡萄（V. pseudoreticulata）白河-35-1在白粉病病原菌侵染后诱导表达的SBP（SQUAMOSA promoter binding protein, SBP）转录因子cDNA。本研究就是通过对中国野生葡萄SBP转录因子cDNA序列进行分析,根据其保守区、非保守区设计引物,分别构建以保守区和非保守区为目的基因的RNAi植物表达载体,通过花序浸润法转化拟南芥,初步了解SBP家族基因的功能。获得以下主要结果:1.分别构建了中国野生葡萄SBP转录因子cDNA保守区和非保守区的RNAi植物表达载体。通过对中国野生葡萄SBP转录因子cDNA进行结构分析,预测基因保守和非保守区域。根据其保守和非保守区序列以及pENTRTMTOPO vector要求设计合成两对特异引物:SBPb-F5’CAC CGC AGG TTT GAC TCC CCT TCA CAT AG 3’, SBPb-R5’AGA GCC ACA CAT ACG CAG ACA GC 3’, SBPf-F5’CAC CGA AAA ATG CAA GCC AAG TAT CAA 3’, SBPf-R5’TCT CAA GAG GAG TTC CAC CAT AG 3’,并进行PCR扩增,将获得的目的片段定向连接到pENTRTM/D-Topo载体,经过PCR检测和测序分析得到正确入门克隆载体后,分别与目的载体pHellsgate8进行LR反应,利用PCR扩增和XHoI、XBaI单酶切检测鉴定,获得SBP转录因子保守区和非保守区的RNAi植物表达载体pHellsgate8-SBPb和pHellsgate8-SBPf。2.获得了具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株。通过农杆菌介导的花序浸润法转化拟南芥,在含卡那霉素40mg/L的MS培养基中对T0代转化植株的种子进行抗性筛选,获得了48株pHellsgate8-SBPb转基因拟南芥和63株pHellsgate8-SBPf转基因拟南芥。分别提取T1代转基因拟南芥的DNA,经PCR检测初步证明目的基因已导入拟南芥。3.中国野生葡萄SBP转录因子功能分析。将野生拟南芥和转基因拟南芥转入基质中生长两个月后,对获得的抗性植株表型进行观察,在pHellsgate8-SBPb的转基因植株中发现一株不抽薹不开花的转基因突变体植株。与野生型拟南芥相比,其叶色浓绿且叶缘缺刻明显,营养生长旺盛,而其他抗性植株与野生型拟南芥相比,表现出生长势较弱,抽薹分枝数和角果数都较少。初步证明中国野生葡萄SBP转录因子可能与植株抽薹开花有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 RNA 干扰技术
• 1.1.1 RNAi 的发现
• 1.1.2 RNA 干扰技术原理
• 1.1.3 RNAi 作用的特点
• 1.1.4 RNAi 技术在植物研究中的应用
• 1.2 植物转录因子
• 1.2.1 转录因子的结构
• 1.2.2 DNA 结合区
• 1.2.3 转录调控区
• 1.2.4 与植物抗病反应有关的转录因子
• 1.3 SBP 转录因子的研究进展
• 1.3.1 SBP 转录因子的发现
• 1.3.2 SBP 家族的功能
• 1.4 本研究目的意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒和菌株
• 2.1.3 酶和主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 常用抗生素贮存液
• 2.1.6 培养基及缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 中国野生葡萄SBP 转录因子RNAi 载体的构建
• 2.2.2 冻融法导入农杆菌
• 2.2.3 转基因植株的获得及初步筛选
• 2.2.4 SBP 转录因子功能分析
• 第三章 结果和分析
• 3.1 中国野生葡萄SBP 转录因子RNAI 载体构建
• 3.1.1 SBP 转录因子cDNA 片段的扩增
• TM/D-SBP 的构建及PCR 鉴定'>3.1.2 入门克隆载体pENTR^TM/D-SBP 的构建及PCR 鉴定
• 3.1.3 植物干扰表达载体pHellsgate8-SBPb/f 的PCR 和酶切鉴定
• 3.1.4 农杆菌EHA105 转化pHellsgate8-SBP 后的PCR 鉴定
• 3.2 转基因植株的获得及初步筛选
• 3.2.1 抗卡那霉素（kan）转基因植株的获得
• 3.2.2 转基因拟南芥的PCR 检测
• 3.3 SBP 转录因子功能分析
• 第四章 讨论
• 4.1 花序浸润法转化拟南芥应注意的问题
• 4.2 LR 反应中出现的问题
• 4.3 关于SBP 转录因子功能
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介