半夏蛋白的分离纯化及结构分析

论文摘要

半夏为天南星科植物半夏（Pinellia ternata（Thunb.） Breit.）的块茎,是一种重要的中药材。半夏为广布物种,主要分布于东南亚地区,国内资源丰富,以长江流域居多。半夏内用可燥湿化痰,降逆止呕,消痞散结;外用可用于消炎,另外也可作为杀虫剂使用。半夏含有多种活性成分,如活性多糖、生物碱、甾醇和半夏蛋白等。近年来研究发现,半夏蛋白是半夏抗肿瘤、抗生育和抗虫作用的主要有效成分。天然药物中的有效成分通常十分复杂,而半夏中所含蛋白质就不少于十种。随着半夏蛋白的深入研究,如何获得大量满足研究要求的纯化半夏蛋白就变的十分重要。目前报道的半夏蛋白纯化方法主要包括疏水色谱、亲和色谱和离子交换色谱等,但都存在一些缺陷,而不能满足进一步研究的要求。本研究在此基础上,首先尝试利用凝胶过滤从0.45硫酸铵饱和度盐析提取的半夏总蛋白中分离得到一种纯度仅为80%相对分子量约12KDa的半夏蛋白;又尝试了Sephadex G-50和MBP Trap HP亲和柱组合分离,从0.45～0.8硫酸铵饱和度盐析提取的半夏总蛋白中先后分离得到两种半夏蛋白,相对分子量分别约为22KDa和40KDa,纯度约90%;但两种方法重复性均极低,不利于后续研究。而后,选用了疏水层析直接对0.45硫酸铵饱和度盐析提取的半夏总蛋白进行分离纯化,也得到一种相对分子量约为12KDa的半夏蛋白,虽然重复性提高,纯度可达90%,但该方法对操作条件要求极高而不利于大量提纯;最后我们根据半夏凝集素对甘露糖具有专一亲和的性质,以甘露糖为亲和配基,环氧活化琼脂糖凝胶为介质,制备了一种甘露糖-Sepharose4B凝胶,并从0.95硫酸铵饱和度盐析提取蛋白中分离得到纯度在95%以上的一种半夏凝集素,其相对分子量为12.165KDa,且重复性高,操作方便,可以大量分离以满足后续试验。研究还发现该方法受到半夏凝集素与甘露糖配基两者之间疏水性的直接影响。后续研究表明该半夏凝集素为一种糖蛋白;能使小白鼠血红细胞产生凝集反应,最低反应浓度为25μg/ml,而≤12.5μg/ml时小白鼠血红细胞未见明显凝集反应;对该半夏凝集素进行的氨基酸组成分析表明该凝集素中含有15种氨基酸,其中天冬氨酸含量最高,半胱氨酸含量最低,与一般植物凝集素相符。本文还对半夏凝集素的原核表达及纯化做了研究,主要内容是利用含半夏凝集素（PTA）基因的表达载体pET-28a（+）转化大肠杆菌BL21（DE3）,鉴定转化成功后,IPTG诱导表达培养,经SDS-PAGE分析,存在与预期相符的表达蛋白,相对分子量约为30KDa,且该蛋白为不溶性的包涵体。超声波裂解菌体分离包涵体,利用表达蛋白中的组氨酸标签进行Ni柱亲和纯化,筛选最优条件,获得大量半夏凝集素。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1.1 半夏的研究进展
• 1.1.1 半夏概述
• 1.1.2 半夏的化学成分
• 1.1.3 半夏的药理作用
• 1.1.4 半夏的组织培养研究
• 1.2 植物凝集素概述
• 1.2.1 植物凝集素的分类
• 1.2.2 植物凝集素与糖结合特性
• 1.2.3 植物凝集素的防御功能
• 1.2.4 植物凝集素在基因工程中的应用
• 1.3 半夏蛋白概述
• 1.3.1 半夏蛋白含量测定
• 1.3.2 半夏蛋白的分离纯化
• 1.3.3 半夏蛋白的结构性质
• 1.3.4 半夏蛋白的生物学功能
• 1.3.5 半夏蛋白的作用
• 1.4 小结
• 第二章 实验设计
• 2.1 实验目的和意义
• 2.2 研究内容
• 2.3 实验流程图
• 第三章 半夏总蛋白的提取
• 3.1 材料、试剂与仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 试剂及其配制
• 3.2 方法与内容
• 3.2.1 半夏总蛋白提取
• 3.2.2 SDS-PAGE 电泳分析
• 3.2.3 两种产地植物半夏中半夏蛋白SDS-PAGE 的比较
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 半夏蛋白的提取及分析
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 提取半夏蛋白的分离纯化
• 4.1 试剂与仪器
• 4.1.1 试剂及其配制
• 4.1.2 仪器
• 4.2 方法与内容
• 4.2.1 半夏蛋白的Sephadex G-50 凝胶过滤和MBP 亲和层析分离
• 4.2.2 提取半夏蛋白的疏水层析策略
• 4.2.3 提取半夏蛋白的亲和层析策略
• 4.2.4 凝胶层析
• 4.2.5 纯化半夏蛋白的SDS-PAGE 电泳（方法与上同）
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 半夏蛋白Sephadex G-50 凝胶过滤和MBP 亲和层析分离
• 4.3.2 提取蛋白的疏水层析纯化
• 4.3.3 甘露糖-Sepharose 4B 亲和层析纯化
• 4.3.4 凝胶层析结果分析
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 半夏蛋白的部分特性与氨基酸组成分析
• 5.1 材料、试剂与仪器
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 试剂及其配制
• 5.1.3 仪器
• 5.2 方法与内容
• 5.2.1 质谱检测
• 5.2.2 糖蛋白的测定
• 5.2.3 血凝效价测定
• 5.2.4 氨基酸组成分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 质谱结果分析
• 5.3.2 糖蛋白的测定结果分析
• 5.3.3 凝血效价测定结果分析
• 5.3.4 氨基酸组成结果分析
• 5.4 小结与讨论
• 第六章 半夏蛋白的原核表达和纯化
• 6.1 材料、试剂与仪器
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 试剂及其配制
• 6.2 方法与内容
• 6.2.1 pET-28a 和pEasy T1-pta 的双酶切
• 6.2.2 酶切产物处理
• 6.2.3 连接反应
• 2 法）'>6.2.4 BL21-Star 感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 6.2.5 连接产物的转化
• 6.2.6 重组质粒的筛选与鉴定
• 6.2.7 目的基因的诱导表达
• 6.2.8 SDS-PAGE 分析表达产物
• 6.2.9 重组蛋白的分离纯化
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 PCR 扩增目的基因的琼脂糖凝胶电泳检测
• 6.3.2 重组质粒pET-28a-pta 的双酶切鉴定
• 6.3.3 pET-28a-pta 诱导表达的SDS-PAGE 分析
• 6.3.4 重组蛋白的Ni 亲和纯化结果分析
• 6.4 小结与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录：学位论文发表情况