慢病毒介导shRNA沉默Fgl2基因对心肌微血管内皮细胞增殖、迁移的影响及其机制的研究

论文摘要

目的：原代分离培养大鼠心肌微血管内皮细胞（Myocardial Microvascular Endothelial Cells MMVECs）,通过免疫荧光鉴定。构建人纤维介素（fg12）的RNA干扰慢病毒表达载体,转染MMVECs。转染96小时后,qRT-PCR检测fgl2、Ang1、Ang2、Tie2、AKT2的表达。探讨fg12对MMVECs增殖、迁移的影响及其机制。方法：（1）心肌微血管内皮细胞的分离培养与鉴定：取5-7天龄健康、清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠,取出心脏,洗净血液,剪去心房及右心室,保留左心室,剥离心内膜及心外膜。酒精灭活30秒。剪碎心肌组织,用胰蛋白酶及胶原酶Ⅱ消化,消化分离细胞,经差速贴壁,获得较纯的MMVECs。待原代内皮细胞长成单层融合后,进行传代。取第二代MMECs,免疫荧光检测内皮细胞重要标志物FⅧ相关抗原及CD31相关抗原。（2）在GeneBank中查到人纤维介素fg12（NM006682）的碱基序列,设计4个SiRNA序列,并制备含正义链和反义链的双链DNAoligo,退火合成双链DNA（引物）,与经Agel/EcoRI酶切pGCSIL-GFP载体连接,产生pGCSIL-Fgl2慢病毒载体,经Agel/EcoRI酶切电泳筛选阳性克隆,测序鉴定。pGC-LV、pHelper 1.0、pHelper慢病毒载体共转染293T细胞,包装生产慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平来测定病毒滴度。（3）实验分组：取大鼠第三代MMVECs,实验A组：单纯MMVECs（对照组）；实验B组；空载质粒慢病毒（GFP组）；实验C组：fg12短发夹RNA （short hairpin RNA;shRNA）慢病毒（fgl2-RNAi-LV组）。稳定转染4天后,实时定量qRT-PCR（quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR）检测各组fg12、Angl、Ang2、Tie2、AKT2的mRNA表达。MTT检测细胞增殖。Transwell检测细胞迁移能力。结果：（1）原代心肌微血管内皮细胞培养成功,纯度达95%左右,呈铺路石样结构。（2）免疫荧光法检测,显示90%以上细胞的FVⅢ、CD31阳性,FⅧ主要分布在细胞胞浆,呈绿色荧光,CD31主要分布在细胞膜,呈红色荧光。（3）酶切及DNA测序表明,fgl2shRNA慢病毒表达载体构建成功。包装慢病毒,测得浓缩病毒滴度为1*109TU/ml,转染fgl2shRNA慢病毒96 h后,70-80%的MMVECs表达GFP,qRT-PCR结果显示,与实验A组与B组比较,实验C组的龟12表达明显下调,Ang1、Ang2、Tie2、AKT2明显上调,MMVECs的增殖能力与迁移能力增强。具有统计学差异（P<0.05）,而实验A组与实验B组无明显差异。结论：fgl2shRNA慢病毒载体构建成功,转染fgl2shRNA慢病毒载体后MMVECs的fg12表达水平明显下调,Ang1、Ang2、Tie2、AKT2明显上调；fgl2shRNA慢病毒转染MMVECs,MMVECs的增殖能力与迁移能力增强,可能通过上调Ang1和Ang2的表达来促进血管生成,fg12基因通过RNA干扰为治疗血管新生障碍性疾病提供了新的靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要试剂配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 器材的准备
• 2.2.2 心肌微血管内皮细胞培养与鉴定
• 2.2.3 Fgl2shRNA慢病毒载体的构建
• 2.2.4 阳性克隆的PCR鉴定及DNA测序鉴定及westernblot外源靶选
• 2.2.5 慢病毒包装
• 2.2.6 实验分组
• 2.2.7 慢病毒转染大鼠MMVEC s
• 2.2.8 细胞总RNA提取及鉴定
• 2.2.9 qRT-PCR测定各组MMVECs中Fgl2、Ang1、Ang2、Tie2、Akt2mRNA的表达
• 2.2.10 MTT检测内皮细胞增殖能力
• 2.2.11 Transwell检测细胞迁移能力
• 2.2.12 统计学分析
• 第3章 实验结果
• 3.1 心肌微血管内皮细胞形态学观察
• 3.2 培养细胞免疫荧光法鉴定
• 3.3 Fgl2shRNA慢病毒载体的构建、鉴定及外源靶选
• 3.4 孔稀释测定病毒滴度及慢病毒转染MMVECs
• 3.5 Transwell检测细胞迁移能力
• 3.6 MTT检测内皮细胞增殖能力
• 3.7 qRT—PCR检测Fgl2shRNA慢病毒转染MMVECs96小时后Fgl2、Ang1、Ang2、Tie2、Akt2mRNA的表达变化
• 第4章 讨论
• 4.1 乳鼠心肌微血管内皮细胞培养与鉴定
• 4.2 Fgl2-shRNA慢病毒载体转染心肌微血管内皮细胞及对其增殖、迁移血管新生的影响
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献