论文摘要
糖尿病患者异常的高血糖状态所引起的一系列病理变化是糖尿病患者牙种植失败的重要原因。因此,有效地控制血糖、减轻种植体周围因糖尿病而发生的病理变化,增强种植体骨愈合能力成为糖尿病患者牙种植治疗的关键。采用胰岛素或其他药物系统治疗可缓解糖尿病对口腔局部种植体愈合的不利影响,但作用有限。目前,临床上还没有理想的治疗方法。为验证刘洪臣提出的人工种植牙给药的可行性,提高糖尿病患者牙种植的成功率,观察糖尿病常用治疗药物对种植体局部骨细胞的代谢、增殖、矿化的影响并研究其作用机制十分必要。二甲双胍（Metformin,MF）应用临床40余年,已经证明能有效的降低血糖,改善胰岛素抵抗,是目前治疗2型糖尿病的一线用药,但MF对成骨细胞的作用如何,国内外少见报道。本实验采用了大鼠下颌骨来源的成骨细胞,并在体外模拟高糖环境,再观察MF对其慢性刺激后的大鼠下颌骨成骨细胞生物活性和葡萄糖摄取的影响,并探讨其可能的作用机制,为MF经人工种植牙给药提供实验依据。第一部分二甲双胍对高糖环境大鼠下颌骨成骨细胞增殖、分化和矿化的影响目的:探讨MF对高糖培养的大鼠下颌骨成骨细胞增殖、分化和矿化功能的影响。方法:分离培养大鼠下颌骨成骨细胞,分别给予5.5mM葡萄糖（5.5mMG）（生理糖浓度）、16.5mMG（高糖）浓度的培养液配制的不同浓度MF培养,用MTT法检测成骨细胞的增殖,确定药物最适浓度,RT-PCR检测Ⅰ型胶原的表达,生化法测定碱性磷酸酶（ALP）活性、钙吸收,放免法检测骨钙素含量,茜素红S钙染法检测矿化结节形成情况。结果:一定浓度二甲双胍能够促进5.5mMG浓度培养的成骨细胞的增殖,Ⅰ型胶原基因表达,钙吸收,矿化小结形成及钙沉积;在高糖条件下,二甲双胍促进成骨细胞的ALP活性,Ⅰ型胶原基因表达,但抑制骨钙素的分泌、钙吸收、矿化小结的形成及钙沉积。结论:在生理糖浓度下,MF促进大鼠下颌骨成骨细胞的增殖、分化和矿化,但高糖引起MF作用的改变,MF表现出促细胞分化但抑制矿化的作用。第二部分二甲双胍对高糖环境大鼠下颌骨成骨细胞葡萄糖摄取的影响实验一高糖对大鼠下颌骨成骨细胞葡萄糖摄取的影响目的:探讨高糖对胰岛素诱导的下颌骨成骨细胞葡萄糖摄取和葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter1,GLUT1）和GLUT3表达的影响。方法:分离培养大鼠下颌骨成骨细胞,分别予以5.5mM、16.5mMG处理细胞,持续24h,加入1×10-8mol/L胰岛素（Ins）干预24h。采用氟-18（F-18）标记的脱氧葡萄糖(18F-FDG)测定成骨细胞的葡萄糖摄取,GLUT1、GLUT3表达水平的检测采用Western blot法。结果:在5.5mMG培养时,Ins能够显著增加细胞对葡萄糖的摄取,同时也显著增强细胞的GLUT1蛋白表达水平;在16.5mMG培养时,细胞的葡萄糖摄取无明显变化,但GLUT1的表达明显增加,Ins的应用对葡萄糖摄取无明显影响,但显著下调了GLUT1的表达。5.5mMG组未检测到GLUT3表达;16.5mMG时,有GLUT-3的表达,胰岛素可以使GLUT3表达明显上调。结论:高糖能够引起成骨细胞对胰岛素的敏感性下降,诱导成骨细胞产生胰岛素抵抗,其作用机制与GLUT1、GLUT3的活性和功能的改变有关。实验二二甲双胍对高糖环境大鼠下颌骨成骨细胞葡萄糖摄取的影响目的:探讨MF对高糖培养的下颌骨成骨细胞葡萄糖摄取和葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter1,GLUT1）和GLUT3表达的影响。方法:分离培养大鼠下颌骨成骨细胞,分别予以5.5mM、16.5mMG处理细胞,持续24h,加入或不加入400μmol/L MF和1×10-8mol/L胰岛素（Ins）干预24h。采用氟-18（F-18）标记的脱氧葡萄糖(18F-FDG)测定成骨细胞的葡萄糖摄取,GLUT1、GLUT3表达水平的检测采用Western blot法。结果:在5.5mMG培养条件下,MF、Ins及MF+Ins均显著促进GLUT-1表达,其中,MF和MF+Ins组的促GLUT-1表达效应更强;在16.5mMG培养时,GLUT-1的表达明显上调,MF、Ins和MF+Ins均能下调高糖培养条件下的GLUT-1表达,其中,MF和MF+Ins组与5.5mMG组比较无明显差异,而Ins组则使GLUT-1表达进一步下调,较5.5mMG组比较明显下降。5.5mM时未检测到GLUT3表达;16.5mM时,有GLUT-3的表达,MF、Ins、MF+Ins均显著促进GLUT3表达上调,以MF+Ins作用最强。结论:MF能够促进胰岛素抵抗的成骨细胞的葡萄糖摄取,增强成骨细胞的胰岛素敏感性,GLUT1、GLUT3的表达和活性的调节在葡萄糖摄取的过程中发挥重要作用。