本文主要研究内容
作者徐永涛（2019）在《猪链球菌2型LAMP快速检测方法的建立》一文中研究指出：随着养殖业的快速发展,大型规模化养殖场增多,饲养密集,在此条件下,猪群免疫力下降,应激因素增多。导致主要寄居于上呼吸道中的机会致病性链球菌发病率逐年上升,对养猪厂造成了严重的经济损失。尤其是1998年和2005年新出现的由猪链球菌2型导致的中毒休克综合症（STSS）,更是对人类的生命安全构成严重威胁。SS2致病性较强,若发现不及时,后期即使给予大量抗生素治疗,亦不能避免瘫痪、耳聋、失明、运动失调等严重的神经性后遗症的发生,最终只能作为残猪淘汰。由于传统的检测方法,PCR技术、血清学、生化反应和免疫学手段等,大多数耗时较长,且对仪器设备的要求较高,而链球菌有35个血清型,导致在用传统方法检测的时候造成试剂与耗材的大量消耗,且传统检测方法,如PCR等,所需仪器价格普遍较贵,操作也繁琐,不利于在基层推广应用。LAMP（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术能够克服上述传统检测仪器昂贵,耗时较长的缺点,且检测快速准确,能够在基层推广应用。本次试验根据LAMP原理,通过NCBI查找猪链球菌2型毒力因子保守序列设计两种引物。溶菌酶释放蛋白（Muramidase.released protein,MRP）毒力因子和荚膜多糖2J（Capsular polysaccharide,CPS 2J）毒力因子为模板分别选择6个区域设计两套共8条特异性引物,通过对反应条件和试剂浓度的优化建立了对SS2的LAMP检测方法,且对其特异性、灵敏度进行了检测。1.最佳反应体系的筛选通过设置单因素梯度变化分别对反应体系中的内外引物比（F3:FIP,B3:BIP）、Mg2+最终浓度、dNTPs终浓度进行了优化,外引物与内引物比梯度为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6,Mg2+终浓度梯度为0 mM、1mM、2mM、3 mM、4 mM、5 mM,dNTPs终浓度梯度为0 mM、1 mM、2 mM、3mM、4 mM、5 mM。最终确立了LAMP反应的最佳反应体系:在MRP毒力因子下外引物各0.2μM,内引物各0.6μM,Mg2+终浓度为2 mM,dNTPs终浓度为3 mM,10×ThermoPol缓冲液2.5μL,Bst DNA Polymerase 1μL,模板1μL,补水至25μL。在CPS2J毒力因子下外引物各0.1μM,内引物各0.3μM,Mg2+终浓度为2 mM,dNTPs终浓度为1 mM,10×ThermoPol缓冲液2.5μL,Bst DNA Polymerase 1μL,模板1μL,补水至25μL。2.最佳反应条件的优化通过设置单因素梯度分别对反应温度和反应时间进行优化,反应温度梯度为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃,反时间梯度为20 min、30min、40 min、50 min、60 min、70 min。结果显示MRP毒力因子下的引物在62℃时间40 min即可完成扩增。CPS2J毒力因子下的引物下61℃时间30 min完成扩增。3.LAMP灵敏性检测对SS2基因组DNA进行10-n倍梯度稀释,使用100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释的基因组为模板分别进行常规PCR反应和LAMP反应,通过比较两种反应最低检测核酸浓度结果来反映LAMP反应的敏感性。结果显示LAMP方法敏感性是PCR的100倍,最低检出量为0.215 pg/μL。4.LAMP特异性检测分别以SS2、SS7、SS9、SS14、沙门氏菌（Salmonella enteriditis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、副猪嗜血杆菌为模板,用本研究所建立的方法进行LAMP反应,验证该方法的特异性。结果表明该方法仅SS2能扩增出特异性条带,加入荧光染料之后有绿色荧光。其他细菌均不能,证明该方法具有较好的特异性。本研究成功的建立了SS2的LAMP快速检测方法,该方法操作简便、灵敏度高、特异型强,用肉眼能直观的观察实验结果,适用于基层和现场快速诊断,为SS2的临床诊断提供了有效的理论支撑。
Abstract
sui zhao yang shi ye de kuai su fa zhan ,da xing gui mo hua yang shi chang zeng duo ,si yang mi ji ,zai ci tiao jian xia ,zhu qun mian yi li xia jiang ,ying ji yin su zeng duo 。dao zhi zhu yao ji ju yu shang hu xi dao zhong de ji hui zhi bing xing lian qiu jun fa bing lv zhu nian shang sheng ,dui yang zhu an zao cheng le yan chong de jing ji sun shi 。you ji shi 1998nian he 2005nian xin chu xian de you zhu lian qiu jun 2xing dao zhi de zhong du xiu ke zeng ge zheng （STSS）,geng shi dui ren lei de sheng ming an quan gou cheng yan chong wei xie 。SS2zhi bing xing jiao jiang ,re fa xian bu ji shi ,hou ji ji shi gei yu da liang kang sheng su zhi liao ,yi bu neng bi mian tan huan 、er long 、shi ming 、yun dong shi diao deng yan chong de shen jing xing hou wei zheng de fa sheng ,zui zhong zhi neng zuo wei can zhu tao tai 。you yu chuan tong de jian ce fang fa ,PCRji shu 、xie qing xue 、sheng hua fan ying he mian yi xue shou duan deng ,da duo shu hao shi jiao chang ,ju dui yi qi she bei de yao qiu jiao gao ,er lian qiu jun you 35ge xie qing xing ,dao zhi zai yong chuan tong fang fa jian ce de shi hou zao cheng shi ji yu hao cai de da liang xiao hao ,ju chuan tong jian ce fang fa ,ru PCRdeng ,suo xu yi qi jia ge pu bian jiao gui ,cao zuo ye fan suo ,bu li yu zai ji ceng tui an ying yong 。LAMP（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）ji shu neng gou ke fu shang shu chuan tong jian ce yi qi ang gui ,hao shi jiao chang de que dian ,ju jian ce kuai su zhun que ,neng gou zai ji ceng tui an ying yong 。ben ci shi yan gen ju LAMPyuan li ,tong guo NCBIcha zhao zhu lian qiu jun 2xing du li yin zi bao shou xu lie she ji liang chong yin wu 。rong jun mei shi fang dan bai （Muramidase.released protein,MRP）du li yin zi he jia mo duo tang 2J（Capsular polysaccharide,CPS 2J）du li yin zi wei mo ban fen bie shua ze 6ge ou yu she ji liang tao gong 8tiao te yi xing yin wu ,tong guo dui fan ying tiao jian he shi ji nong du de you hua jian li le dui SS2de LAMPjian ce fang fa ,ju dui ji te yi xing 、ling min du jin hang le jian ce 。1.zui jia fan ying ti ji de shai shua tong guo she zhi chan yin su ti du bian hua fen bie dui fan ying ti ji zhong de nei wai yin wu bi （F3:FIP,B3:BIP）、Mg2+zui zhong nong du 、dNTPszhong nong du jin hang le you hua ,wai yin wu yu nei yin wu bi ti du wei 1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6,Mg2+zhong nong du ti du wei 0 mM、1mM、2mM、3 mM、4 mM、5 mM,dNTPszhong nong du ti du wei 0 mM、1 mM、2 mM、3mM、4 mM、5 mM。zui zhong que li le LAMPfan ying de zui jia fan ying ti ji :zai MRPdu li yin zi xia wai yin wu ge 0.2μM,nei yin wu ge 0.6μM,Mg2+zhong nong du wei 2 mM,dNTPszhong nong du wei 3 mM,10×ThermoPolhuan chong ye 2.5μL,Bst DNA Polymerase 1μL,mo ban 1μL,bu shui zhi 25μL。zai CPS2Jdu li yin zi xia wai yin wu ge 0.1μM,nei yin wu ge 0.3μM,Mg2+zhong nong du wei 2 mM,dNTPszhong nong du wei 1 mM,10×ThermoPolhuan chong ye 2.5μL,Bst DNA Polymerase 1μL,mo ban 1μL,bu shui zhi 25μL。2.zui jia fan ying tiao jian de you hua tong guo she zhi chan yin su ti du fen bie dui fan ying wen du he fan ying shi jian jin hang you hua ,fan ying wen du ti du wei 60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃,fan shi jian ti du wei 20 min、30min、40 min、50 min、60 min、70 min。jie guo xian shi MRPdu li yin zi xia de yin wu zai 62℃shi jian 40 minji ke wan cheng kuo zeng 。CPS2Jdu li yin zi xia de yin wu xia 61℃shi jian 30 minwan cheng kuo zeng 。3.LAMPling min xing jian ce dui SS2ji yin zu DNAjin hang 10-nbei ti du xi shi ,shi yong 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8xi shi de ji yin zu wei mo ban fen bie jin hang chang gui PCRfan ying he LAMPfan ying ,tong guo bi jiao liang chong fan ying zui di jian ce he suan nong du jie guo lai fan ying LAMPfan ying de min gan xing 。jie guo xian shi LAMPfang fa min gan xing shi PCRde 100bei ,zui di jian chu liang wei 0.215 pg/μL。4.LAMPte yi xing jian ce fen bie yi SS2、SS7、SS9、SS14、sha men shi jun （Salmonella enteriditis）、da chang gan jun （Escherichia coli）、ku cao ya bao gan jun （Bacillus subtilis）、fu zhu shi xie gan jun wei mo ban ,yong ben yan jiu suo jian li de fang fa jin hang LAMPfan ying ,yan zheng gai fang fa de te yi xing 。jie guo biao ming gai fang fa jin SS2neng kuo zeng chu te yi xing tiao dai ,jia ru ying guang ran liao zhi hou you lu se ying guang 。ji ta xi jun jun bu neng ,zheng ming gai fang fa ju you jiao hao de te yi xing 。ben yan jiu cheng gong de jian li le SS2de LAMPkuai su jian ce fang fa ,gai fang fa cao zuo jian bian 、ling min du gao 、te yi xing jiang ,yong rou yan neng zhi guan de guan cha shi yan jie guo ,kuo yong yu ji ceng he xian chang kuai su zhen duan ,wei SS2de lin chuang zhen duan di gong le you xiao de li lun zhi cheng 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自河南科技大学的徐永涛，发表于刊物河南科技大学2019-09-18论文，是一篇关于猪链球菌型论文,环介导等温扩增论文,灵敏性论文,特异性论文,河南科技大学2019-09-18论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自河南科技大学2019-09-18论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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